骨硬化蛋白在雌激素缺乏大鼠牙槽骨改建过程中的表达

郭颖， 王红， 车双江， 宓努， 杨晓喻

1. 深圳大学总医院口腔科，广东 深圳（518000）；2. 深圳华侨城医院口腔科，广东 深圳（518000）；3. 南方医科大学口腔医院种植中心，广东 广州（510280）

骨硬化蛋白（sclerostin）是骨细胞特异性分泌的含有胱氨酸结的糖蛋白，由SOST 基因编码，其发现源于Van Buchem 病（弥漫性骨皮质增生症）的研究，该疾病患者的SOST 基因突变导致sclerostin不能表达或功能缺陷，造成患者过度的骨形成，出现巨头畸形和下颌骨增大等临床症状［1⁃2］。研究表明，在四肢骨中sclerostin 可以通过骨细胞突触形成的骨小管网络，作用于成骨细胞从而抑制骨形成，而其抗体可以促进骨形成［3］。绝经后女性全身骨质疏松发展迅速，与体内雌激素缺乏有关。牙槽骨是围绕在牙根周围、支持牙齿的组织，是身体骨质密度较低的骨组织，较容易发生骨质疏松，在口腔中多表现为牙槽骨吸收，牙齿松动甚至脱落［4］。因牙槽骨受到的咀嚼压力和牙齿生理性移位作用，在雌激素缺乏状态下骨细胞可能具有不同于其他部位（例如四肢骨）骨组织的生理表现，有研究表明卵巢摘除大鼠模型下颌骨出现明显的骨吸收，同时骨小梁的结构变化也不同于四肢骨［5］。大鼠下颌磨牙存在生理性远中移位，牙槽间隔近牙周膜区域受压迫出现生理性牙槽骨改建。尽管牙槽骨中的骨细胞可能感受到生理性压力并影响骨代谢，但由于这种生理性压力很难被检测到，所以这方面的研究少有报道。本实验采用摘除大鼠卵巢，构建骨质疏松大鼠模型加速这种生理性牙槽骨改建，通过组织学和免疫组织化学染色，观察雌激素缺乏状态下sclerostin 在牙槽骨中的表达，探讨雌激素与牙槽骨改建之间的关联性。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

选取由深圳大学医学部实验动物中心提供的8 周龄雌性Wistar 大鼠32 只，本实验所有实验流程均遵守深圳大学动物实验的指导方针，本实验得到深圳大学医学部实验动物伦理委员会批注。

sclerostin 抗体（安迪生物，美国），羊抗兔IgG⁃HRP（安迪生物，美国），ALP 抗体（Jackson Immuno Research Laboratories，美 国），鼠 抗 兔IgG⁃HRP（Jackson Immuno Research Laboratories，美国），兔抗鼠核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor⁃κB ligand，RANKL）抗体（Oriental Yeast Co，日本），大鼠抗小鼠IgG⁃HRP（Zymed labo⁃ratories Inc，美国），DAB 试剂盒（Abcam，英国），萘酚AS⁃BI 磷酸盐（Naphthol AS⁃BI phosphate）（西格玛，美国），酒石酸钠（Sodium Tararic）（Sigma，美国），固蓝RR 盐（fast blue RR salt）（Sigma，美国），PBS（博世德公司，武汉），Tris⁃HCl（鼎国公司，北京），组织蛋白银溶液（Protargol⁃S）（Sigma，美国）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将32 只大鼠随机分成假手术（sham⁃operated）Sham 组 和 卵 巢 摘 除（ovariecto⁃mized）OVX 组，Sham 组16 只，OVX 组16 只。用2%戊巴比妥钠按照50 mg/kg 腹腔麻醉，在背部腰椎正中做2 cm 皮肤切口，钝性分离腰椎双侧肌层进入腹腔，完整切除双侧卵巢，止血，逐层缝合，标记为OVX 组。以相同方法切开入路进入腹腔，仅切除少量脂肪组织，止血，缝合，标记为Sham 组。

1.2.2 标本制备 术后1、2、3、4 周使用心脏灌注法处死大鼠：腹腔注射4%水合氯醛（0.01 mL/g）麻醉，切开右心耳，在左心室心尖向心内缓慢推注生理盐水，至流出液体清亮，再推注4%多聚甲醛溶液至大鼠变僵硬。取大鼠下颌骨，4%多聚甲醛溶液4 ℃固定。12 h 后取出，10%中性EDTA 溶液中室温脱钙2 个月，进行脱水、透明、浸透、包埋，按平行于下颌第一磨牙近远中向连续切片，切片厚度为2 μm。

1.2.3 TRAP染色 使用30 mL PBS缓冲液稀释2.5 g萘酚AS⁃BI 磷酸盐，18 mg 酒石酸钠配制孵育液调整pH 值5.0，脱蜡切片滴入孵育液37 ℃孵育15 min，蒸馏水洗3 min，苏木素复染30 s，水洗10 min反蓝，封片。

1.2.4 免疫组织化学染色 sclerostin 染色：切片脱蜡后，PBS 冲洗3 次，每次3 min。过氧化氢酶阻断剂室温孵育30 min 后，滴加1∶500 比例的sclerostin抗体，4 ℃避光过夜孵育。次日，PBS 冲洗，IgG⁃HRP 抗体室温孵育15 min。最后加入DBA 显色液。

ALP/TRAP/sclerostin 免疫多重染色：sclerostin单独免疫染色（步骤同上）后，再滴加1∶200 的ALP抗体，4 ℃避光孵育2 h，再加入1∶100 IgG⁃HRP 耦联抗体在室温中孵育1 h，最后滴入由2.5 mg 萘酚AS⁃BI 磷酸盐，18 mg 固蓝RR 盐和30 mL 0.1M Tris⁃HCl 配制的混合溶液，室温下孵育30 min，使ALP显色。最后进行TRAP 染色。

RANKL/TRAP 免疫染色：将组织切片脱蜡后，PBS 冲洗3 次，每次3 min。过氧化氢酶阻断剂室温孵育30 min 后，1∶100 比例RANKL 抗体，4 ℃避光过夜孵育。次日，PBS 冲洗，加入IgG⁃HRP 耦联抗体，室温孵育15 min。最后加入DBA 显色液。之后进行按照TRAP 流程染色。

Sclerostin/TRAP/镀银染色：将脱蜡组织切片放入1.5%组织蛋白银溶液（pH 7.4）在37 ℃温箱放置40 h，用蒸馏水冲洗，再放入含有0.2%对苯二酚，0.2%柠檬酸，0.7%硝酸银混合溶液中5 min 固色，再放入含有2.5%无水硫酸钠，0.5%溴化钾，2.5%二氨基酚混合溶液中5 min，最后放入含有1%氯化金和2%草酸二氨酚钠中直至显出黑色。再依次进行按照上述过程进行sclerostin 免疫染色和TRAP染色。

1.3 图像分析

在每张切片第一磨牙牙槽骨间隔区域（近中牙根与牙槽间隔中线至根尖区域），使用Image Pro Plus6.2 图像分析软件测量TRAP 阳性破骨细胞数量；选取近牙周膜区域和牙槽间隔中心区域选取长200 μm、宽120 μm 的两个研究区域，使用Image Pro Plus6.2 图像分析软件测量sclerostin 阳性骨细胞计数和总骨细胞计数，并分析sclerostin 阳性骨细胞在每个计量区域的比例，均由同一研究者测量所有Sham 组和OVX 组的数据并重复3 次后取平均值。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0 软件进行数据分析。不同组别测量破骨细胞数量以及sclerostin 阳性骨细胞计数和总骨细胞计数比例。计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析以及Tukey′s 检验进行组间比较；方差不齐采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRAP 阳性破骨细胞在牙槽间隔区域分布情况

OVX 组术后1 周近牙周膜区域和牙槽间隔中心区域中少见破骨细胞；随着术后时间增加，OVX组近牙周膜区域和牙槽间隔中心区域逐渐出现明显的多核、胞浆红染的破骨细胞，OVX 1w 组（94.9± 13.1）与Sham 1w 组（92.1 ± 11.4）牙槽间隔区域TRAP 阳性破骨细胞数量差异无统计学意义（P＝0.10），而OVX 2w 组（147.8 ± 18.2）和Sham 2w 组（110.3 ± 15.4）、OVX 3w 组（200.3 ± 13.8）和Sham 3w 组（130.4 ± 20.4）、OVX 4w 组（297.3 ± 12.9）和Sham 4w 组（120.5 ± 14.5）间TRAP 阳性破骨细胞数量差异均有统计学意义（P＜0.05），同时Sham各组间TRAP 阳性破骨细胞数量差异无统计学意义（P＝0.3）。OVX 4w 组的破骨细胞数量最多，并出现明显骨吸收陷窝，且OVX 各组间TRAP 阳性破骨细胞数量差异有统计学意义（P＝0.006）（图1）。

2.2 Sclerostin阳性骨细胞在牙槽间隔区域分布情况

随着术后时间延长，Sham 组近牙周膜区域sclerostin 阳性表达未见明显变化：Sham 1w 组（76.3% ± 8.6%），Sham 2w 组（77.1% ± 7.3%），Sham 3w 组（76.9% ± 4.9%），Sham 4w 组（77.6% ± 4.7%）。

随着术后时间延长，OVX 组近牙周膜区域sclerostin 阳性表达逐渐降低，虽然OVX 1w 组（75.1% ± 6.4%）和OVX 2w 组（65.1% ± 5.8%）、OVX 3w 组（43.2% ± 7.4%）与OVX 4w 组（37.6% ±6.0%）阳性表达比例差异无统计学意义（P＞0.05），但相较于OVX 1w 组和OVX 2w 组，OVX 3w组、OVX 4w 组阳性表达比例明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

在牙槽间隔中心区域OVX 各组OVX 1w 组（77.6% ± 9.3%），OVX 2w 组（73.8% ± 7.9%），OVX 3w 组（76.6% ± 9.8%），OVX 4w 组（77.9% ± 8.9%）与Sham 各组Sham 1w（75.5% ± 7.6%），Sham 2w（74.5% ± 6.9%），Sham 3w（78.3% ± 5.8%），Sham 4w（79.1% ± 5.4%）均可见大量sclerostin 阳性表达；Sham 各组间、OVX 各组间及术后同周Sham 组和OVX 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

在同组近牙周膜区域与牙槽间隔中心区域相比观察中，Sham 各组差异无统计学意义（P＞0.05）；而OVX 3w 组和OVX 4w 组，近牙周膜区域sclerostin 阳性表达比例均低于牙槽间隔中心区域，且差异有统计学意义（P＜0.05）；OVX 1w 组、OVX 2w 组近牙周膜区域与牙槽间隔中心区域差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 近牙周膜区域ALP/TRAP/sclerostin 免疫染色分布情况

在Sham 4w 组近牙周膜区域可观察到TRAP 阳性（红色）破骨细胞周围有ALP 阳性（蓝色）成骨细胞表达，并且有大量sclerostin 阳性（褐色）骨细胞表达。OVX 4w 组较Sham 4w 组中成熟的破骨细胞数量更多，破骨细胞周围均可见成骨细胞分布，而sclerostin 阳性骨细胞在OVX 4w 组更少（图3）。

2.4 近牙周膜区域RANKL/TRAP 免疫染色

OVX 4w 组近牙周膜区域可见大量RANKL 阳性标记（褐色）成骨细胞、前成骨细胞和红色深染的破骨细胞，而且强阳性RANKL 标记几乎均围绕在TRAP 红色深染的破骨细胞周围；Sham 4w 组较OVX 4w 组少见RANKL 阳性标记细胞和仅见少量破骨细胞（图4）。

Figure 2 The distribution of sclerostin⁃positive osteocytes in the alveolar bone septum of the mandibular first molar in the OVX groups图2 OVX 各组下颌第一磨牙牙槽间隔区域sclerostin 阳性骨细胞分布

Figure 3 Triple staining of ALP，TRAP and sclerostin in the area near the periodontal ligament of the alveolar bone septum of the mandibular first molar in the Sham 4w group and OVX 4w group图3 Sham 4w 组和OVX 4w 组下颌第一磨牙近牙周膜区域ALP/TRAP/ sclerostin 三重免疫染色

2.5 近牙周膜区域牙槽骨骨小管分布情况

Figure 4 The distribution of osteoblasts，preosteoblasts and osteoclasts in the area near the periodontal ligament of the alveo⁃lar bone septum of the mandibular first molar in the Sham 4w group and in the OVX 4w group by RANKL/TRAP staining图4 RANKL/TRAP染色显示Sham 4w组和OVX 4w组下颌第一磨牙近牙周膜区域成骨细胞、前成骨细胞、破骨细胞分布

在Sclerostin/TRAP/镀银三重染色中可以观察到近牙周膜区域Sham 4w 组和OVX 4w 组sclerostin阳性骨细胞周围见规则骨小管。同时，Sham 4w 组和OVX 4w 组围绕在破骨细胞周围的sclerostin 阴性骨细胞见不规则骨小管（图5）。

Figure 5 Distribution of the bone tubules in the area near the periodontal ligament of the alveolar bone septum of the mandibular first molar in the Sham 4w and the OVX 4w group by sclerostin/ TRAP/sliver staining图5 Sclerostin/TRAP/镀银染色显示Sham 4w 组和OVX 4w 组下颌第一磨牙近牙周膜区域牙槽骨骨小管分布

3 讨 论

牙周炎是发生在牙周组织的慢性炎症，是我国成年人失牙的主要原因［6⁃7］，其中牙周炎与女性绝经期的关系近年来受到学者们的关注［4］。研究证明，女性绝经期性腺功能减退，激素水平显著下降，是引起牙槽骨吸收和牙齿脱落的主要原因之一［8］。牙周膜细胞具有多分化潜能，在机械刺激、激素水平变化等作用下可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞等，来维持牙周组织的代谢和平衡，参与牙槽骨改建［9⁃10］。Sclerostin 是骨细胞特异性分泌的含有胱氨酸结的糖蛋白，可以通过骨细胞突触形成的骨小管网络作用于成骨细胞从而抑制骨形成，在口腔成牙骨质细胞、成牙本质细胞、牙周组织和牙槽骨细胞中都有存在［11］。雌激素缺乏骨质疏松症是以骨量下降、骨微细结构破坏为特点的骨骼疾病，骨密度较疏松的牙槽骨部位容易受到影响［12］。

目前，“去势大鼠”是FDA 和WHO 推荐的研究雌激素水平下降形成骨质疏松症的模型［13］，此类模型优势在于：大鼠饲养方便，价廉，去势术简便，高存活率，高成功率，易重复，易再现，周期短（15 d），适用广泛，术后表现与人类雌激素缺乏骨质疏松症后的骨代谢、骨微结构变化相似，因而最常选择该法。研究证实，雌性Wistar 大鼠经手术切除双侧卵巢后，骨吸收远高于骨形成，骨量丢失较严重［14］。

研究报道［15］，骨质疏松症模型评价指标包括：骨密度测定、X 线吸收法、定量CT 测定、骨计量学观察、生化学指标、骨生物力学指标等。骨计量学是骨组织形态计量学的简称，主要研究对象是二维骨组织切片显微图像，以生理学和骨组织学为依据，通过分析并处理显微图像，获得骨组织结构的计量参数。该方法的优势在于：①利用其较高的分辨率，是唯一一种能够观察骨组织细胞的方法；②骨吸收和形成参数和免疫标记法能科学有效地反映骨计量学变化。本研究建立了卵巢摘除后雌激素缺乏大鼠模型，并利用骨组织形态计量学的方法进行研究。结果显示，在近牙周膜区域OVX 组sclerostin 阳性表达随时间延长显著减少，推测雌激素缺乏状态会抑制牙槽骨细胞分泌sclerostin。近年发现，雌激素具有促进成骨细胞增殖矿化的作用，包括抑制成骨细胞凋亡，减弱氧化应激反应，降低sclerostin 活性等［16］。Li 等［17］的研究也显示在卵巢摘除大鼠的牙槽骨中sclerostin 分泌受到抑制，本实验与其结果一致。然而，本实验结果还显示，在牙槽间隔中心区域OVX 各组牙槽骨细胞sclerostin 阳性表达无明显差异。雌激素缺乏使sclerostin 分泌减少的假设，并不能完全解释本实验中仅在近牙周膜区域发现sclerostin 分泌减少，而在牙槽间隔中心区域牙槽骨细胞分泌sclerostin 无明显减少这一现象。

另外，关于大鼠去势后骨质变化的研究报道，切除卵巢后14 d 胫骨近心端骨量丢失最明显，30 d时股骨颈骨量丧失最多，60 d 时腰椎椎骨骨量丢失达到高峰［18］。本实验结果显示，随着时间延长OVX 组在牙槽间隔近牙周膜区域逐渐出现大量TRAP 阳性破骨细胞，而Sham 组虽然也有TRAP 阳性破骨细胞出现但无明显增量变化。Khosla 等［16］利用去卵巢大鼠的骨髓细胞进行培养，发现破骨细胞明显增多，证明雌激素缺失可增加破骨细胞活性及数目。OVX 组与Sham 组比较，在近牙周膜区域破骨细胞数量更多，而在牙周膜中RANKL 的含量也明显增加。有研究表明牙周膜细胞具有多向分化能力，由此分化而来的前成骨细胞和成骨细胞表达RANKL，可以诱导成熟破骨细胞的分化和增殖［19］。在大鼠摘除卵巢后四肢骨区域破骨细胞增多，骨吸收明显增加，出现骨质疏松症的临床表现［20］。推测在大鼠牙槽间隔近牙周膜区域内，加速进行的骨改建同样影响了牙槽骨细胞分泌sclerostin 的能力。

同时，在OVX 组中牙槽间隔近牙周膜区域发现明显的骨改建线，表明在雌激素缺乏时大鼠牙槽间隔近牙周膜区域骨吸收和骨重建同时存在。本实验观察到OVX 3w 组、OVX 4w 组近牙周膜区域破骨细胞及成骨细胞周围星网状骨细胞陷窝系统分布比较复杂多变，而在牙槽间隔中心区域大量sclerostin 阳性骨细胞星网状分布比较规则，这也可能是近牙周膜区域和牙槽间隔中心区域sclerostin 阳性表达差异的原因之一。复杂多变的星网状骨细胞系统会刺激骨细胞减少sclerostin 的分泌。在活跃的牙槽骨改建中，牙槽骨细胞通过感知星网状系统呈现的不同几何分布，来探知压力的方向和强度，以此为依据及时识别各种细胞间信号，并且通过分泌sclerostin 来调控自身成骨潜能，参与牙槽骨改建［21⁃22］。

本实验初步探究了雌激素缺乏大鼠牙槽骨改建活性与牙槽骨细胞分泌sclerostin 的相互作用关系。目前临床上对于牙槽骨细胞促进骨改建的研究较少，期待在调控牙槽骨改建，增加牙槽骨量方面能有所应用，为治疗牙周炎、提高种植骨量、正畸牙移动等治疗提供新的思路。