上海地区生鲜乳中致病性大肠杆菌的排查

徐 锋 沈莉萍 张维谊 齐新永 陆仲斐 朱培元 王 建*

（1上海市动物疫病预防控制中心，上海市长宁区 201103；2上海市农产品质量安全中心，上海市青浦区 201708）

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中的一大难题，直接影响着牛奶的产量和质量，偶尔也会引起乳品安全问题[1]，而在近几年国内报道的奶牛乳房炎的病原菌中，大肠杆菌占比已超过金黄色葡萄球菌、稳居首位[2-4]，且在生鲜乳中，大肠杆菌也有较高的检出率[5-7]，有的甚至高达50.83%[8]。

上海地区奶牛乳房炎的主要病原菌一直是以金黄色葡萄球菌为主的革兰氏阳性球菌[9-10]，但近几年的相关报道较少。同时，由于《GB 19301-2010 食品安全国家标准生乳》的颁布，取消了对生鲜乳中致病菌的检测，更导致相关数据缺乏。因此，上海地区奶牛乳房炎主要致病菌的变化，是否会导致生鲜乳中致病菌的变化，是否会对上海地区乳品安全造成威胁，还需进行深入探讨和研究。在此背景下，笔者拟对上海地区几家乳品加工厂生产的生鲜乳中的大肠杆菌进行摸底调查，以期了解其污染程度、致病性、耐药性及血清型分布情况，从而评估生鲜乳中的大肠杆菌对食品安全是否存在风险，并拟通过对环境样本中大肠杆菌进行检测，查找可能的污染源，以便采取相应的措施，避免或减少生鲜乳中大肠杆菌的污染。现将相关研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样 本

生鲜乳样本：分别于2019年9月和12月分2次进行样本采集，共80份样本，采集自上海的3个乳品加工厂，样本来源于40个奶牛养殖场。

环境样本：2019年9月—12月分4次采样，共163份样本，包括乳头奶、乳房表面拭子、操作人员手部拭子、奶罐奶、奶衬表面拭子、垫料、饲料、土壤、粪便等，均采自同一个标准化奶牛场。

1.1.2 培养基

EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MAC）、Columbia血琼脂基础等培养基均购自北京陆桥。

1.1.3 试 剂

产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）细菌的核酸测定试剂盒购自上海之江；大肠杆菌肠道产毒性（ETEC）、肠道侵袭性(EIEC)、肠道致病性（EPEC）分型血清购自兰州生物制品研究所；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列详见表1。

1.1.4 主要仪器

仪器主要是微生物质谱鉴定仪（VITEK MS，法国生物梅里埃）、荧光PCR仪（7500，ABI）、普通PCR仪（Biometra TAdvanced，德国耶拿）。

1.2 排查方法

1.2.1 样本处理

生鲜乳、乳头奶等液体样本和拭子样本直接取样；垫料、饲料、土壤和粪便样本称取5 g加入到含50 mL灭菌生理盐水的无菌过滤袋中，充分混匀，然后取滤液作为检测样本。

1.2.2 生鲜乳中菌落总数的测定

吸取25 mL样品至盛有225 mL灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分混匀，制成10-1样品匀液；取1 mL 10-1样品匀液至9 mL灭菌生理盐水无菌试管中进行10倍稀释，依次10倍稀释至10-2、10-3、10-4、10-5；吸取1 mL各稀释度的样品匀液，置于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿重复，同时做空白对照；将冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注至平皿中，并转动平皿使其混合均匀；待琼脂凝固后，将平板翻转，于36 ℃±1 ℃下培养48 h±2 h。

表1 PCR引物序列

1.2.3 大肠杆菌的分离鉴定

鉴定：取1 mL检样加入到9 mL EC肉汤培养基中，振荡混匀后于36 ℃培养24 h；用接种环蘸取增菌液分别接种EMB平板和MAC平板，于36℃下培养24 h；然后从EMB平板和MAC平板分别挑取若干可疑菌落，接种Columbia羊血平板进行纯化，于36 ℃下培养18～24 h；再用1 μL接种环挑取单菌落均匀涂在靶板位点上，然后滴加1μL MS-CHCA基质液覆盖在上面，待完全干燥后，放入VITEK MS质谱仪进行鉴定，约10 min后获得鉴定结果。

血清分型：使用大肠杆菌肠道产毒性（ETEC）、肠道侵袭性(EIEC)、肠道致病性（EPEC）血清进行玻片凝集试验。

1.2.4 大肠杆菌毒力基因的检测

对从生鲜乳中分离的大肠杆菌，选择常见的8种毒力基因（K88、K99、987P、F18、F41、STa、STb、LT）进行PCR检测。

反应体系（25 μL）：Taq 酶 preMix 12.5 μL，引物（浓度10 μM）各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O补足至25 μL。

核酸扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、退火温度60 s、72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃-∞。

电泳采取1.5%浓度琼脂糖凝胶。

2 结果与分析

2.1 生鲜乳中的菌落总数

由图1可知，在80份生鲜乳样本中，菌落总数最大值为2 900 CFU/mL，平均值为58.08 CFU/mL。

2.2 大肠杆菌的分离鉴定

通过对从80份生鲜乳样本和163份环境样本中分离的细菌进行VITEK MS鉴定发现，生鲜乳中大肠杆菌的分离率为63.5%，而环境样本中的大肠杆菌主要分离自垫料、土壤、粪便，分离率分别为75%、75%、50%。同时，鉴定还发现肺炎克雷伯菌和其它肠杆菌科细菌也有较高的占比。见图2。

2.3 致病性大肠杆菌的血清分型

由表2可知，从生鲜乳中分离的50株大肠杆菌中，有15株致病性大肠杆菌，其中，肠道产毒性大肠杆菌（ETEC）菌株6株、占比为12%，肠道致病性大肠杆菌（EPEC）菌株9株、占比为18%；肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC)菌株未检出。

2.4 大肠杆菌毒力基因的检测

由图3可知，从生鲜乳中分离的50株大肠杆菌中，检出5株携带K99基因（携带率为10%）、12株携带LT型基因（携带率为24%）、2株携带ST基因（包括STa和STb，携带率合计为4%）。

表2 致病性大肠杆菌血清分型

3 结论与讨论

3.1 结 论

研究结果表明，上海地区生鲜乳中的菌落总数远低于国家标准要求，符合国家规定；生鲜乳中大肠杆菌的检出率较高，且有致病性大肠杆菌及其肠毒素的存在，故不宜直接食用；致病性大肠杆菌在巴氏灭菌乳中可能有残留，在冷藏条件下可增殖，对乳品安全存在风险，建议对生鲜乳中致病性大肠杆菌进行监控，以杜绝隐患。

3.2 讨 论

生鲜乳普遍采用巴氏消毒法进行灭菌，通常采用65 ℃维持30 min或75～90 ℃维持15 s，但最近有报道表明，大肠杆菌O157:H7在80 ℃维持10 min，仍不能被完全杀灭[11]，说明巴氏消毒奶细菌总数的达标，不等于杀灭了所有的致病性大肠杆菌，且其在8 ℃左右仍可繁殖[12]，一旦冷链出现问题或超过保质期，就会影响奶质，甚至会造成食物中毒。同时，在近几年的奶牛乳房炎病原菌检测中，大肠杆菌的占比居高不下。上海市及其周边地区奶牛场的乳房炎奶牛乳中大肠杆菌的检出率通常在20%～40%[3，13-14]。而本研究结果表明，上海地区生鲜乳中的菌落总数均未超标，但大肠杆菌的分离率高达63.5%，这可能与上海地区潮湿的气候有关，且大肠杆菌耐热并能在低温增殖的特点也是一个重要因素。

大肠杆菌是人和动物肠道内的常在菌，其分布极为广泛，生活中几乎无处不在，通常认为是一种条件致病菌。本研究结果表明，环境样本中垫料、土壤、粪便中的大肠杆菌分离率较高，证实了奶牛场环境中确实存在大量的大肠杆菌，而奶牛场是开放式环境，空气流动、人员走动、野生动物走动、运输工具流动等都有可能造成污染，故要及时清除污染物，且采用科学的消毒方法就显得尤为重要[15]。同时，在乳头奶、乳房表面及操作人员手部等环境样本中也分离到大肠杆菌，预示在整个挤奶过程中可能存在消毒不到位的问题，需要对消毒剂的选择、稀释浓度、作用时间和人员的防范意识等进行优化。此外，在奶牛场的奶罐奶中未检出有大肠杆菌，这与生鲜乳中的菌落总数结果（平均58.08 CFU/mL）相符，说明上海地区生鲜乳的细菌污染程度较低，上海地区的奶源质量是有保障的。

ETEC是引起人和动物腹泻的重要病原菌，其特征性的致病因子为肠毒素和黏附素。本研究中ETEC的检出率为12%，而肠毒素基因的检测率合计为28%（热敏肠毒素LT基因为24%，耐热肠毒素ST基因为4%），表明有一半的菌株未鉴定出血清型，而这些菌株均有可能具有致病性。同时，鉴于LT肠毒素在60 ℃维持15 min才可被灭活，ST肠毒素在100 ℃维持15 min还能保持活性[16]，而本研究的肠毒素检测结果以LT基因为主，ST基因只有个别菌株携带，表明上海地区的生鲜乳经巴氏消毒后，大部分大肠杆菌肠毒素可被灭活而失去致病性，残存的少量ST肠毒素被大量牛奶稀释后对人类健康已不构成威胁，但仍存在隐患，需要在源头进行根除。此外，ETEC和EPEC是引起犊牛腹泻和败血症的主要病原菌，而规模化奶牛场以K99菌毛致病菌株的致病率最高[17]，本研究仅检出K99基因，该结果与姜宣鹏等报道的奶牛场黏附素基因的检测结果一致[18]，说明本研究分离的部分大肠杆菌菌株来源于奶牛，且具有较强的致病性。

EPEC大多会引起幼畜和婴幼儿腹泻[19]，严重的甚至可以致死[20]。近几年，在我国有关EPEC的感染发病已鲜有报道。本研究中EPEC的检出率为18%，涉及O26、O44、O55、O114、O125五个血清群，这些血清型在国内的牛源大肠杆菌中也均有检出[21-22]，但由于EPEC同EHEC在遗传和表型上很近，尤其是O26血清群和O55血清群的一些血清型归属于EHEC，其有很强的致病性，且本研究未检测出志贺毒素及相关毒力基因，故目前无法进行区分，需要进一步开展更加细致深入的研究。