结核感染T细胞斑点试验在结核病临床诊断中的应用

张晓梅，黄 鹏

(1.南昌大学公共卫生学院循证医学中心，南昌 330006；2.上饶市人民医院检验科，江西 上饶 334000；3.江西省预防医学重点实验室，南昌 330006)

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的，以侵犯人体呼吸系统为主的传染病。近年来，由于MTB耐药性的增加，流动人口的增多，以及一些致人体自身免疫力明显下降的疾病如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、血液病以及肿瘤等增多，结核病的发病率逐渐上升。2019年WHO[1]估计，2018年全世界约有1000万人罹患结核病，有150万人死于该疾病。我国是全球结核病高发区的国家之一，防控形势比较严峻，早期诊断该疾病对于其防治具有重要意义。常见的结核病的实验室诊断方法有很多，但都有一定的局限性。近年新发展的T-SPOT.TB具有灵敏度高、特异度高、结果快速等优点，已广泛地应用于临床结核病的诊断[2]。本文通过对T-SPOT.TB在肺结核、肺外结核、结核潜伏感染中的临床诊断应用进行综述，旨在为临床结核病的实验室诊断提供更多依据或线索。

1 结核病实验室诊断的常规方法及其特点

常见的结核病实验室诊断方法主要有：涂片抗酸染色、结核菌素试验(TST)、抗结核分枝杆菌抗体(TB-Ab)检测、结核分枝杆菌核酸(TB-DNA)检测和结核分枝杆菌培养等，这些方法都有各自的优缺点。1)抗酸染色涂片检查:特异度高，但是灵敏度较低。喻容等[3]的研究结果显示，抗酸染色的灵敏度为17.25%；秦庆等[4]报道的灵敏度为11.46%，特异度为98.96%。2)TST:TST特异度较低，有学者[5-6]报道诊断小儿结核感染TST的灵敏度为66.7%，但特异度仅为40%；因其与卡介苗(BCG)和非结核分枝杆菌感染会产生交叉反应，容易产生假阳性。3)TB-Ab检测：TB-Ab是以体液免疫应答为基础的免疫学诊断方法，该方法操作简单快速，容易判断结果，但是引起TB-Ab试验假阳性和假阴性的因素较多，其灵敏度和特异度均较低，在确诊的活动性结核病中TB-Ab的阳性率为61.5%[7]。4)TB-DNA检测：PCR技术测定TB-DNA的灵敏度和特异度较高，在WANG等[8]的研究中肺结核和肺外结核总的灵敏度为92.11%，特异度为82.61%；但是PCR技术对实验室环境和技术人员的要求均较高，且标本容易污染，结果容易出现假阳性。新近发展的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)是目前国内外实验室诊断结核病中最优的一种方法。Xpert MTB/RIF不仅可以检测TB-DNA，而且可以确认利福平耐药基因[9]。SHEN等[10]的Meta分析结果显示：Xpert MTB/RIF诊断骨关节结核的总灵敏度为0.81(95%CI:0.77～084)，总特异度为0.99(95%CI:0.97～1.00)。5)结核分枝杆菌培养：此技术仍是目前临床上诊断结核病的金标准，但培养周期长，约需3～6周时间才能出结果，且培养要求较高，培养阳性率偏低。结核分枝杆菌培养的方法包括传统罗氏(L-J)固体培养法和MGIT 960液体培养法。MA等[11]对232例骨结核脓液标本做了传统L-J固体培养基和MGIT 960液体培养基培养结核分枝杆菌的比较研究，结果显示：2种方法检出结核分枝杆菌总阳性率为31.0%(72/232)，在检出的72例阳性标本中，MGIT 960液体培养法阳性检出率为94.4%，高于L-J固体培养法阳性检出率(75.0%)。由此可见，MGIT 960液体培养法优于传统L-J法。但另有研究[12]报道，MGIT 960液体培养法培养结核分枝杆菌的阳性检出率虽然高于L-J法，但是MGIT 960的污染率(15%)高于L-J的污染率(9.3%)。

2 结核感染T细胞斑点试验的原理及特点

体外γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)近年来受到了临床的广泛关注，它是一项以T细胞免疫为基础的检查方法。目前应用于临床的IFN-γ释放试验主要有2种：一种是QFT-GIT试验，该试验的方法是采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结核特异性抗原刺激的致敏T细胞所释放的IFN-γ浓度；另一种是T-SPOT.TB，该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量[13]。目前IGRA的检测在临床实验室中使用最广泛的检测方法是T-SPOT.TB。

T-SPOT.TB检测的基本原理是采用ELISPOT技术，检测分泌细胞因子的T细胞。结核感染的免疫应答是以T细胞免疫应答为主，机体感染MTB后，体内产生抗原特异性效应T细胞，当再次被结核抗原刺激时，这些效应T细胞分泌细胞因子IFN-γ[2]。实验时，采集静脉全血，分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，PBMCs和结核特异RD1区的抗原即ESAT-6和CFP-10，加入到包被了抗IFN-γ抗体的板孔内培养；加入的特异性抗原刺激所有的致敏T细胞分泌IFN-γ，IFN-γ被反应板上的抗IFN-γ抗体捕获，洗去细胞后，捕获的IFN-γ与加入的酶标二抗结合，加入底物进行酶联显色，在反应板底部形成斑点，每一个斑点代表了一个分泌细胞因子IFN-γ的T细胞，根据斑点数量可以判断体内是否存在针对MTB免疫反应的效应T细胞的数量[14]。由于ESAT-6和CFP-10均来自MTB基因组RDl区域，除结核分枝杆菌存在RDl区外，其他的如牛分枝杆菌、BCG和大多数环境分枝杆菌该区域均缺失，因此T-SPOT.TB方法不受BCG、环境分枝杆菌感染等的影响，具有灵敏度高、特异度高等特点[2,5]。

3 T-SPOT.TB的应用

3.1 外周血T-SPOT.TB在肺结核临床诊断中的应用

《中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断(WS288-2017)》指南[15]中提出肺结核诊断的实验室免疫学检查需IGRA阳性。一项来自波兰的研究[16]显示：IGRA和TST的灵敏度在菌阳性和菌阴性的病例中结果基本无区别，IGRA灵敏度菌阳性组为55.8%，菌阴性组为64.9%，TST的灵敏度菌阳性组为65.1%，菌阴性组为55.6%。由此可见，IGRA和TST对菌阴性肺结核病人的诊断价值差异不明显，但是IGRA可评估病情的进展，随着肺结核病情的加重，IGRA水平会下降。在韩国延世大学针对224例菌阴性疑似肺结核病例全血IGRA的回顾性研究[17]中指出，在肺结核的诊断中IGRA优于TST，94例活动性肺结核IGRA的灵敏度(81.9%)、阴性预测值(82.7%)分别高于TST的灵敏度(58.1%)和阴性预测值(51.9%)。FENG等[18]通过检测180例活动性结核病人的T-SPOT.TB和TST，结果显示：活动性肺结核组T-SPOT.TB的灵敏度(95.6%)、特异度(69.2%)明显高于TST，T-SPOT.TB的诊断比值比(DOR)为10.71，提示T-SPOT.TB对肺结核有较高的诊断价值。虽然TST诊断结核也有一定作用，但是不能区分是接种了疫苗还是结核分枝杆菌感染。胡玉欣等[19]在选取菌阴性肺结核患者进行T-SPOT.TB的研究中显示：T-SPOT.TB灵敏度和特异度分别为95.5%和89.6%，其结果优于抗结核分枝杆菌抗体和血沉实验，在结合患者结核病病史、结核接触史以及影像学检查进行的基于Logistic回归模型ROC曲线提示，T-SPOT.TB在肺结核的诊断中具有较高的诊断价值(ROC曲线下面积为0.937)。

另有研究[20-21]报道，T-SPOT.TB试验不仅对肺结核的诊断有较高的临床价值，而且可以判断肺结核的抗结核治疗的疗效。蘭景双等[20]研究发现，肺结核T-SPOT.TB的灵敏度和特异度分别为95.1%和91.3%，结核患者治疗30、60、90和120 d的T-SPOT.TB阳性率分别为83.5%、67.7%、35.4%和10.2%，提示T-SPOT.TB是否转阴可判断治疗疗效。YAN等[21]对活动性肺结核和肺外结核检测T-SPOT.TB研究中发现，抗结核治疗前的灵敏度为80.62%，治疗期间的灵敏度为60.67%，且观察了治疗1个月、1年、1年以上的T-SPOT.TB阳性率，结果显示随着治疗时间的延长，其灵敏度逐步下降。

3.2 外周血T-SPOT.TB在肺外结核临床诊断中的应用

肺外结核是指发生在肺部以外的其他器官的结核病，常见有结核性淋巴结炎、骨关节结核、结核性心包炎、神经系统结核以及泌尿系统结核等。肺外结核通常没有特定的临床表现，给临床早期诊断带来了困难。有研究[18]显示T-SPOT.TB对肺外结核的诊断有很高的价值。TANG等[22]对86例骨关节结核病人进行的实验室检查显示，T-SPOT.TB的灵敏度为81.4%，高于Xpert MTB/RIF(70.9%)，但是T-SPOT.TB的特异度低于XpertMTB/RIF，两个项目联合检测则诊断价值更高，其灵敏度和特异度分别为91.9%和96.7%。王香梅等[23]认为，T-SPOT.TB诊断肺外结核的灵敏度为87.5%，特异度为90.6%，阳性预测价值为84.8%,阴性预测值为92.3%，均明显高于TST，且T-SPOT.TB的ROC曲线下面积(0.886)高于TST(0.612)。一项关于IGRA诊断结核性淋巴结炎的Meta分析[24]结果显示，T-SPOT.TB诊断结核性淋巴结炎的总灵敏度为0.90(95%CI:0.86～0.94)，总特异度为0.74(95%CI:0.69～0.78)，ROC曲线下面积为0.98，提示该法具有较高的诊断准确性，可作为对结核病非侵入性诊断工具的补充。ZHOU等[25]的Meta分析结果显示：T-SPOT.TB诊断肺外结核的总灵敏度和总特异度分别为0.82(95%CI:0.77～087)和0.75(95%CI:0.67～0.83)，略高于QFT-GIT试验的0.78(95%CI:0.71～0.84)和0.71(95%CI:0.63～0.78)。

3.3 外周血T-SPOT.TB在结核潜伏感染临床诊断中的应用

机体最初感染MTB后，大部分感染者机体有免疫反应但表现为无临床症状特征的潜伏结核感染(LTBI)，5%～15%的潜伏结核感染者在2～5年内会发展为活动性结核病[26]。在免疫力低下及长期大量使用糖皮质激素等免疫抑制剂的人群中潜伏结核感染发展为活动性结核风险更高，如HIV感染者、自身免疫性疾病、血液病等。有研究[27]报道，HIV合并结核潜伏感染的患者CD4+T淋巴细胞下降明显，约有14%的患者CD4+T淋巴细胞<100 μL-1，因此，T-SPOT.TB的阳性率很低，仅有11%，低于QFT-GIT试验。YU等研究[28]报道，T-SPOT.TB用于诊断HIV合并结核感染的灵敏度和特异度分别为41.3%和94.6%，高于TST(12.9%和91.8%)，2种试验方法并联可提高灵敏度(45.2%)，串联可提高特异度(100%)。

自身免疫性疾病人群中结核潜伏感染比较常见。赵丽萍等[29]采用T-SPOT.TB筛查226例患者，发现风湿免疫病组T-SPOT.TB的试验阳性率(39.39%)与非风湿免疫病组阳性率(46.53%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示T-SPOT.TB试验对风湿免疫病患者筛查结核分枝杆菌潜伏感染有一定诊断价值。毕艳等[30]分析研究了T-SPOT.TB在结核潜伏感染者免疫抑制剂治疗的临床应用，结果显示T-SPOT.TB的阳性率和确诊率(36.4%、94.9%)高于TST(28.4%、69.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)，且对T-SPOT.TB阳性的病人进行预防性抗结核治疗，随访1年后无1例结核病发生。因此，T-SPOT.TB检测在自身免疫性疾病的结核潜伏感染诊治中具有重要的临床应用价值。

国外2项IGRA在结核潜伏感染诊断的系统评价和Meta分析[31-32]结果表明，T-SPOT.TB在结核潜伏感染临床诊断中有较高的临床价值，且评价指标优于QFT-GIT和TST。来自加拿大[31]的T-SPOT.TB诊断结核潜伏感染的系统评价结果显示，T-SPOT.TB的总灵敏度为0.90(95%CI:0.86～0.93)，总特异度为0.93(95%CI:0.86～1.00)，明显高于TST。DIEL等[32]的Meta分析显示，T-SPOT.TB在潜伏感染中总特异度达到100%(95%CI:97.6%～100%)，而TST的总特异度为88.7%(95%CI:84.6%～92.0%)。

3.4 体液T-SPOT.TB在结核病临床诊断中的应用

T-SPOT.TB除了对外周血的T细胞进行检测外，越来越多的实验证明[33-37]在体液中进行T-SPOT.TB检测更有助于结核病的诊断。机体感染结核分枝杆菌后，效应T细胞从外周血向活动性结核感染部位集中，此时体液T-SPOT.TB检测比外周血特异度更高，而脑脊液由于血脑屏障的作用，其T-SPOT.TB的灵敏度低于外周血[14,38-39]。ZHANG等[33]采用浆膜腔积液T-SPOT.TB诊断结核性浆膜炎的前瞻性研究显示，浆膜腔积液T-SPOT.TB的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于外周血，阴性似然比低于外周血。一项在心包积液T-SPOT.TB诊断结核性心包炎的研究[34]中，心包积液T-SPOT.TB各项评价指标均高于外周血，2种试验并联提高了灵敏度(100%)，串联提高了特异度(97.0.%)。XU等[35]的研究联合检测胸腔积液T-SPOT.TB和胸腔积液ADA诊断结核性胸膜炎的结果显示：胸腔积液T-SPOT.TB的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、ROC曲线面积均高于外周血，阴性似然比低于外周血，3种试验联合的Logistic回归结果显示：灵敏度、特异度、ROC曲线下面积分别为0.979(95%CI:93.4～99.6)、0.875(95%CI:82.0～89.6)、0.964(95%CI:0.934～0.995)。LIAO等[36]也报道了胸腔积液T-SPOT.TB有很高的诊断价值，灵敏度为95.7%，特异度为100%。

在IGRA诊断结核性胸膜炎的Meta分析[37]中，胸水T-SPOT.TB的灵敏度为0.95(95%CI:0.93～0.97)，特异度为0.84(95%CI:0.78～0.89)，DOR为88.5，ROC曲线下面积为0.98；外周血T-SPOT.TB的灵敏度为0.82(95%CI:0.78～0.85)，特异度为0.77(95%CI:0.69～0.83)，DOR为19.82，ROC曲线下面积为0.89。由此可见，胸水T-SPOT.TB各项评价指标比外周血的诊断效能更高。

4 ELISPOT试验在临床结核病诊断中的应用展望

就目前研究来看，T-SPOT.TB尚不能完全鉴别诊断潜伏性结核感染与活动性结核感染，而且试剂盒成本较高。不过，有文献[40-41]报道，丙氨酸脱氢酶(ALaDH)抗原刺激T细胞产生的白介素-2(IL-2)的ELISPOT试验可用于区分活动性结核和潜伏性结核感染，且诊断结核病的灵敏度、特异度、ROC曲线下面积均高于T-SPOT.TB试验。LI等[42]报道由北京金豪制药公司生产的结核感染T细胞试剂(TS-SPOT试剂盒)成本更低，且TS-SPOT各项试验评价指标与T-SPOT.TB相比差异无统计学意义，2种试验的Kappa值为0.91(0.85～0.95)，具有良好的一致性。

5 结语

综上，结核感染T细胞斑点试验不受机体免疫状态影响，其选用的结核特异性抗原(ESAT-6，CFP-l0)不受环境分枝杆菌和卡介苗的影响，故优于传统的抗结核分枝杆菌抗体和结核菌素试验。结核感染T细胞斑点试验在肺结核、肺外结核、结核潜伏感染的诊断和筛查中都有很高的临床应用价值，尤其是体液T-SPOT.TB的检测对结核病的诊断具有更高的诊断价值。尽管T-SPOT.TB还不能完全鉴别诊断结核潜伏感染与活动性结核感染，且试剂盒成本较高，但随着相关技术的不断发展，仍可寄望其在结核病的诊断方面发挥更大作用。