冬瓜和节瓜疫病的离体叶片接种方法研究

曾莉莎 陈康丽 吕顺 王芳 吴永官 杜彩娴 唐琪璐 黄熊娟 莫安妮 黎炎

摘要：【目的】評估离体叶片接种法对冬瓜疫病抗性鉴定的可行性，建立一种快速高效的冬瓜疫病抗性鉴定方法，并筛选抗疫病的冬瓜和节瓜品种，为培育及利用抗病品种提供参考。【方法】以注射灌根接种法为对照，采用离体叶片接种法对9份冬瓜品种进行抗病性鉴定和比较，评估离体叶片接种法的可行性;并采用所建立的离体叶片接种法对 23份冬瓜品种和18份节瓜品种进行抗病性鉴定，从中筛选抗、耐疫病的冬瓜和节瓜品种。【结果】离体叶片接种后，发病症状主要表现为叶片呈现暗绿色水渍状病斑，后期变成黑色病斑，有的会长出白色霉层。9份供试冬瓜品种中，铁柱168、B184和P33等7份冬瓜品种分别采用两种方法进行抗感性评价，反应类型结果完全一致。两种鉴定方法对冬瓜疫病的抗性鉴定结果一致性高达77.78%：注射灌根接种法发病率的平均值是54.6%，病情指数的平均值是29.6;离体叶片接种法发病率的平均值是60.2%，病情指数的平均值是31.5。对两种接种法的发病率和病情指数进行相关性分析，结果表明注射灌根接种法和离体叶片接种法的相关性达极显著水平（P<0.01），两种接种方法的发病率与病情指数相关系数分别为0.953和0.993。节瓜普遍比冬瓜更抗疫病，初步筛选出3份高抗冬瓜品种，分别是连环杂交大冬瓜、铁心999黑皮冬瓜和黑娃四号小冬瓜，病情指数分别为5.9、9.2和1.7;5份高抗节瓜品种，分别是佳庆338节瓜、玲珑节瓜、翠秀节瓜、新粤农8号和5号黑毛节瓜，病情指数分别为4.2、5.0、5.8、6.7和7.5。【结论】与注射灌根法相比，离体叶片接种法具有发病症状明显、操作方便、速度快、不伤害植物等优点，离体叶片接种法可作为冬瓜品种疫病抗病性鉴定的辅助手段，用离体叶片接种法筛选出3份高抗冬瓜品种和5份高抗节瓜品种可作为培育及利用抗病品种的资源。

关键词： 冬瓜;节瓜;疫病;离体叶片接种法;抗病品种

中图分类号：S642.304.3                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）09-2213-07

In vitro leaves inoculation method for wax gourd and chieh-qua

ZENG Li-sha1， CHEN Kang-li1， LYU Shun1*， WANG Fang1， WU Yong-guan2，

DU Cai-xian1， TANG Qi-lu1， HUANG Xiong-juan2， MO An-ni3， LI Yan2

（1Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan， Guangdong  523061， China; 2Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， China; 3Bureau of Agriculture， Forestry and Water Resources of Xiegang District of Dongguan， Dongguan， Guangdong  523590， China）

Abstract：【Objective】To evaluate the feasibility of in vitro leaves inoculation method and establish a rapid and efficient method for the identification of wax gourd[Benincasa hispida（Thund.）] Phytophthora blight resistance， and then screen the wax gourd and chieh-qua（B. hispida var.chieh-qua） varieties that resistant to Phytophthora blight， which provided references for breeding and utilization of disease-resistant varieties. 【Method】The disease resistance of nine varie-ties of wax gourd were identified and compared by in vitro leaves inoculation and with injection irrigation root inoculation method as control. The feasibility of in vitro leaves inoculation method was evaluated. Moreover， 23 varieties of wax gourd and 18 varieties of chieh-qua were identified for disease resistance through in vitro leaves inoculation， from which disease-resistant wax gourd and chieh-qua varieties were screened out. 【Result】The disease symptoms after in vitro leaves inoculation were dark-green watermark on the leaves at initial stage， which turned into black spot at the later period， and some would develop white fungal mycelium. Among the nine wax gourd varieties tested， seven varieties had the same reaction type results by the two inoculation methods， such as Tiezhu 168， B184 and P33， etc. The two identification methods had the same disease resistance identification results of 77.78%  on wax gourd varieties. The mean values of disease incidence and disease index of injection irrigation root inoculation were 54.6% and 29.6， respectively. The mean values of disease incidence and disease index of in vitro leaves inoculation were 60.2% and 31.5 respectively. Correlation analysis was performed on the incidence and disease index of the two inoculation methods， and the correlation between the two methods reached extremely significant level（P<0.01）. The correlation coefficient between incidence and disease index of injection irrigation root inoculation and in vitro leaves inoculation were 0.953 and 0.993. Chieh-qua was generally more resistant to Phytophthora blight than wax gourd. Three disease-resistant wax gourd varieties were preliminarily screened out， which were Lianhuanzajiao wax gourd， Tiexin 999 black wax gourd and Heiwa 4 small wax gourd， with the disease indexes of  5.9，9.2 and 1.7 respectively. Five disease-resistant chieh-qua varieties were selected out， including Jiaqing 338 chieh-qua， Linglong chieh-qua， Cuixiu chieh-qua， Xinyuenong 8 chieh-qua and No.5 black  chieh-qua， with the disease indexes of 4.2， 5.0， 5.8， 6.7 and 7.5， respectively. 【Conclusion】Compared with injection irrigation root inocu-lation，in vitro leaves inoculation method has the advantages of obvious symptoms， convenient operation， fast speed， and no harm to plants， etc.， which can be used as an auxiliary method for disease resistance identification of wax gourd varie-ties. Three wax gourd varieties and five chieh-qua varieties with high disease resistance can be used as disease-resistant resources for breeding and utilizing.

Key words： wax gourd[Benincasa hispida（Thunb.）];chieh-qua（Benincasa hispida var.chieh-qua）;Phytophthora blight; in vitro leaves inoculation method; disease-resistant varieties

Foundation item： Guangxi Science and Technology Major Project（Guike AA17204026，Guike AA17204039）; Dongguan Social Science and Technology Development Key Project（20200507101163）

0 引言

【研究意义】冬瓜[Benincasa hispida（Thunb.） Cogn]和节瓜（B. hispida var. chieh-qua）因產量高、耐贮运、易栽培及货架期长等优点，深受种植户的喜爱，现已成为调节市场均衡供应的主要蔬菜品种和农产品加工的理想原料，特别是广西、广东、湖南、台湾和海南等省（区）已形成较大的种植规模（焦贤贤，2018;姚金晓和杨飞，2018;张朝明，2018）。随着冬瓜和节瓜种植面积的扩大和种植指数的提高，疫病的发生也进一步加剧，尤其在高温多雨的华南地区发病尤为严重，造成产地大量减产，甚至绝收（陆少峰等，2007）。冬瓜和节瓜疫病是由鞭毛菌亚门真菌疫霉菌（Phytophthora de Bary）侵染所致的一种土传性病害（李卫民等，2007;吴永官等，2012），筛选并选育抗病品种是有效且常用的防治疫病的方法之一，而抗病品系的发掘和利用是培育抗病品种的重要环节，建立一套准确、实用的人工接种抗病性鉴定方法，可加快抗病育种进程。【前人研究进展】邓丽君等（2015）采用离体叶片接种法和活体接种法对甜瓜白粉病进行抗病性鉴定，发现两者鉴定结果基本一致，说明离体叶片接种法可用于甜瓜白粉病生理小种的鉴别和抗源鉴定。朱丽梅等（2015）采用自然病圃法和离体叶片接种法分别对茄子早疫病进行抗病性鉴定比较，鉴定结果基本一致，说明离体叶片菌丝块接种法可作为茄子早疫病抗病性鉴定的辅助手段。刘淼等（2017）报道，用离体叶片接种法和下胚轴伤口接种法对大豆疫霉根腐病进行抗病性鉴定，结果表明两种方法呈极显著相关，且差异不显著，证明采用离体叶片接种法进行大豆疫霉根腐病抗性鉴定同样准确可行。李智军等（2007）、彭铁成等（2012）、孙叶烁等（2019）、孙玉燕等（2019）、徐成翠等（2019）均研究发现离体叶片接种法与活体接种法的鉴定结果相关性非常高，说明离体叶片接种法可用于比较不同作物品种间的抗病性差异。【本研究切入点】冬瓜和节瓜疫病的抗性鉴定和评价常用方法是活体接种法，如注射灌根接种法（谢大森等，2010）。但活体接种法受温度和湿度等外界环境因素的影响较大，容易对植株造成伤害，耗材也大。前人研究（邓丽君等，2015;刘淼等，2017）表明离体叶片接种法具有取材简便、不损害植株、快速、可室内进行等优点。但目前尚未见关于冬瓜和节瓜疫病离体叶片接种法研究的文献报道。【拟解决的关键问题】分别采用离体叶片接种法和注射灌根接种法对9份冬瓜品种进行抗病性鉴定，通过分析两种方法的鉴定结果探讨叶片接种法的可行性;同时，利用离体叶片接种法对23份冬瓜品种和18份节瓜品种进行抗疫病性鉴定评价，从中筛选抗（耐）疫病冬瓜和节瓜品种。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

冬瓜疫病病原菌株（DGYm-1）由广东省农业科学院蔬菜研究所谢大森研究员提供，目前保存在东莞市香蕉蔬菜研究所实验室，经鉴定为瓜类疫霉（Phytophthora melonis）。供鉴定的冬瓜品种包括收集自全国各地的23份冬瓜品种和18份节瓜品种，其中冬瓜品种P33、B184、S9和B214种质资源由广东省农业科学院蔬菜研究所赠送。2017年8月10日全部供试品种定植于东莞市香蕉蔬菜研究所试验地，按照常规栽培管理方式进行种植管理。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌种培养 将冬瓜疫霉病菌菌株取边长为20 cm的正方形接种于2%的胡萝卜琼脂培养基后，于25 ℃暗培养7 d。活体接种前3 d，用蒸馏水浸没培养基上的菌丝诱导游动孢子的形成，接种浓度为1000 CFU/mL。

1. 2. 2 离体叶片接种法 在冬（节）瓜的始果期，于2017年9月25日选取无病虫斑、大小基本一致的鲜嫩叶片，蒸馏水洗净后浸泡15 min，用灭菌吸水纸吸干叶片表面的水分后，将叶片正面朝上排放于置有双层灭菌纱布的不锈钢碟中，每个碟放置1片，每份品种3次重复，加蒸馏水使纱布湿透，备用。把准备好的菌饼移入瓷碟中的叶片，每叶片放置4个菌饼，放置位点与叶片主脉位置一致，菌饼有菌丝的那面紧贴在叶片背面，以只放置无菌琼脂块的叶片处理为对照，用透明封口袋将碟子密封确保其湿润度，28 ℃光照培养下恒温培养，促使病害发生，接种后每隔12 h加水一次，并观察叶片变化情况。接种3 d后调查发病情况，观看发病病斑的大小，取3次重复的平均值。抗感级别评价标准参考王长林和沈镝（2008）对冬瓜和节瓜疫病的分级标准;病情分级标准参考朱丽梅等（2015）对茄子早疫病分级标准，根据材料冬瓜叶片的面积与特征稍做调整，结果如表1。

1. 2. 3 注射灌根接种法 选择23份冬瓜品种中在华南地区主栽培的品种，包括铁柱168、B184、P33、绿宝极早熟冬瓜、B214、莞研1号小冬瓜、小家碧玉小冬瓜、S9和铁心999黑皮冬瓜等9份冬瓜品种，采用注射灌根接种法进行抗病鉴定试验，用于验证比较其与离体叶片接种法的可行性。选取长势健壮、大小基本一致的冬瓜幼苗，于幼苗3片真叶平展时接种，在植株根茎部约3 cm处的土壤中扎3 cm左右孔，注入5 mL瓜类疫霉病菌孢子悬浮液。接种温度22～25 ℃，用无色塑料膜保湿24 h。保湿的植株置于白天25 ℃左右、夜晚18 ℃左右的温室内正常管理。每份材料处理100株，3次重复。接种后7 d调查发病情况，记录发病株数及病级。病情分级标准与抗感级别评价标准参考王长林和沈镝（2008）对冬瓜疫病的分级标准。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 离体叶片接种后发病症状

从接种后第3 d开始观察记录，致病力测定所接种的23份冬瓜品种及18份节瓜品种均有不同程度的发病，发病症状主要表现在植株叶片呈现暗绿色水渍状病斑，后期变成黑色病斑，有的会长出白色霉层，且病斑扩散速度较快。从41份供试材料中选取6份不同抗感病程度的冬瓜和节瓜品种，包括感病品种黑元帅冬瓜、抗病品种一炮冲天冬瓜、中抗品种B214冬瓜、抗病品种广优1号节瓜、抗病品种P33冬瓜和高抗品种5号黑毛节瓜，其发病症状如图1所示。

2. 2 2种接种方法对不同冬瓜品种的抗性鉴定结果

从表2可知，9份供试冬瓜品种中，铁柱168、B184、P33、绿宝极早熟冬瓜、B214、莞研1号小冬瓜和小家碧玉小冬瓜等7份冬瓜品种分别采用两种方法进行抗感性评价的反应类型结果完全一致，可见注射灌根接種法与离体叶片接种法对冬瓜疫病的抗性鉴定结果一致性高达77.78%。铁心999黑皮冬瓜由注射灌根接种法鉴定为抗病品种（病情指数11.4），由离体叶片接种法鉴定结果为高抗品种（病情指数9.2）;S9由注射灌根接种法鉴定结果为抗病品种（病情指数33.6），由离体叶片接种法鉴定结果为中抗品种（病情指数37.1）。从表3可知，对9份冬瓜品种的发病率和病情指数进行相关分析，2种接种方法的发病率和病情指数均达极显著相关水平（P<0.01），相关系数分别为0.953和0.993。注射灌根接种法发病率的平均值是54.6%，病情指数的平均值是29.6;离体叶片接种法发病率的平均值是60.2%，病情指数的平均值是31.5。可见注射灌根接种法的发病率和病情指数的平均值略低于离体叶片接种法。

2. 3 离体叶片接种法对不同冬瓜和节瓜品种的抗性鉴定

从表5可知，离体叶片接种法对23份冬瓜品种的抗性鉴定结果差异相对较大，且大多数不同冬瓜品种间的抗病性存在显著差异（P<0.05）。其中，13.0%的冬瓜品种表现高抗，34.8%的冬瓜品种表现抗病，43.5%的冬瓜品种表现中抗，8.7%的冬瓜品种表现感病。抗性为高抗的冬瓜品种包括连环杂交大冬瓜、铁心999黑皮冬瓜和黑娃四号小冬瓜，其病情指数分别为5.9、9.2和1.7。从表6可看出，离体叶片接种法对18份节瓜品种的抗性鉴定结果差异相对较小，27.8%的节瓜品种表现高抗，50.0%的节瓜品种表现抗病，22.2%的节瓜品种表现中抗。抗性为高抗的5份节瓜品种是佳庆338节瓜、玲珑节瓜、翠秀节瓜、新粤农8号和5号黑毛节瓜，其病情指数分别为4.2、5.0、5.8、6.7和7.5。综合表5和表6可知，冬瓜品种平均发病率达61.2%，平均病情指数达31.5;节瓜品种平均发病率达52.2%，平均病情指数达23.2。可见冬瓜的发病率与病情指数的平均值略高于节瓜。上述结果表明相对冬瓜品种而言，节瓜普遍比较抗病。

3 讨论

冬瓜和节瓜疫病是土传病害，病菌随病残体在土壤或粪肥中越冬，借灌水、气流、风雨等进行传播蔓延（戴子武和周火强，2010），加上华南地区常年高温多雨且湿度大，极易导致冬瓜和节瓜疫病的爆发（程亮，2017）。目前在生产上防治冬瓜和节瓜疫病以化学防治为主，且用药单一（向欣叶等，2016）。大量重复使用化学药剂不仅导致病菌抗药性变异体的出现而使防效降低，还增加生产成本并加剧污染环境（陆少峰等，2007）。因此，选育抗病品种是目前防治冬瓜和节瓜疫病最为经济且有效的方法之一。开展抗病育种工作，育种工作者除需了解抗病机制和抗感病遗传外，还需要掌握一批抗病基因的种质资源。因此，研究并建立一种高效、快速的冬瓜和节瓜抗病性鉴定方法是缩短育种周期、提高育种效率的关键和基础（王彦杰等，2004）。目前，自然病圃法或苗期接种法是抗病品种鉴定较为可靠的方法，但自然病圃法是一个耗时的方法，通常要2个月以上才表现症状，且土壤中病原分布不均匀会造成较大误差。苗期接种法虽然能缩短时间，但还需要创造合适的温湿度等环境条件，离体叶片接种法比苗期接种法减少了育苗与等待接种结果的时间。与注射灌根接种法相比，离体叶片接种法具有操作方便，发病速度快，不易受不可控环境因素的影响等优点。

本研究首次利用离体叶片接种法对冬瓜疫病进行抗病性鉴定，通过与注射灌根法的鉴定结果对比分析，探讨离体叶片接种法的可行性。结果表明两种鉴定方法对77.78%的冬瓜品种抗病性鉴定结果一致，且两种方法的相关性达极显著水平，发病率与病情指数的相关系数分别为0.953和0.993，说明离体叶片接种法能用于区分不同冬瓜品种对疫病的抗病性，离体叶片接种法可作为冬瓜抗疫病品种快速鉴定及筛选的辅助手段。此结果与邓丽君等（2015）、刘淼等（2017）、徐成翠等（2019）的研究结论相似。与注射灌根接种法相比，离体叶片接种法的发病率与病情指数平均值均略高，这可能与叶片比幼苗更容易感染及扩散病菌有关，从而导致叶片的平均发病率与平均病情级数略高于幼苗。此外，叶片是植株可再生的器官，且数量多，同一植株可做多次重复。故与注射灌根接种法相比，离体叶片接种法具有发病症状明显，不伤害植株，单株可重复性等优点。

通过本研究建立的离体叶片接种法，对23份冬瓜品种和18份节瓜品种进行抗病性初步鉴定，结果发现冬瓜的平均发病率与病情指数略高于节瓜，可能与叶片的茸毛有关。节瓜普遍叶片两面均有茸毛，且数量多。而多数冬瓜叶表面有稀疏的柔毛，叶背有粗硬毛，相较节瓜而言较少。植物身上的茸毛是一种防御武器，一定程度上可以抵御病虫害侵害，不同的生理结构导致节瓜普遍比冬瓜抗病。本研究初步筛选出连环杂交大冬瓜、铁心999黑皮冬瓜、黑娃四号黑皮小冬瓜、佳庆338节瓜、玲珑节瓜、翠秀节瓜、新粤农8号节瓜和5号黑毛节瓜等8份高抗疫病的冬（节）瓜品种，以及广东黑皮、佳庆铁心冬瓜、绿宝极早熟冬瓜、翠甜节瓜等14份中抗病的冬（节）瓜品种，可为广东省冬（节）瓜抗病品种资源的筛选评价提供依据，也为利用不同抗病冬瓜和节瓜品种进行合理布局（搭配种植）提供参考。但本研究只是基于离体叶片接种对部分本地主栽冬瓜和节瓜品种的抗病性进行初步鉴定，接下来还需开展更广泛、更深入的盆栽及田间抗病性评价试验，进一步明确不同冬瓜和节瓜品种的抗感病情况。此外，可结合瓜类疫霉菌的平板计数法或荧光定量检测技术，开展不同接种叶片上瓜类疫霉菌的数量测定，进一步验证此方法的可行性。

4 結论

与注射灌根法相比，离体叶片接种法具有发病症状明显、操作方便、速度快、不伤害植物等优点，离体叶片接种法可作为冬瓜品种疫病抗病性鉴定的辅助手段，用离体叶片接种法筛选出3份高抗冬瓜品种和5份高抗节瓜品种可作为培育及利用抗病品种的资源。

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