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山橙内生真菌的抑菌活性初步研究

2020-12-11陈琳黄燕何博林长幸曾东强唐文伟

南方农业学报 2020年9期
关键词:内生真菌生物活性

陈琳 黄燕 何博 林长幸 曾东强 唐文伟

摘要:【目的】從山橙(Melodinus suaveolens Champ. ex Benth)中分离对植物病原真菌具有拮抗活性的内生真菌,为研发新型高效生物农药提供理论依据。【方法】采用组织培养法对山橙进行内生真菌的分离与纯化,结合菌种形态学和18S rDNA序列比对对其内生真菌进行鉴定;采用平板对峙法和菌丝生长速率法测定内生真菌对香蕉枯萎病4号小种、香蕉炭疽病菌和火龙果溃疡病菌等13株供试植物病原真菌的抑菌活性。【结果】从山橙的根、枝和叶中分别分离得到4、5和11株共20株内生真菌,平板对峙测定结果显示其中的菌株M4对白腐盾壳霉菌、向日葵霜霉病菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、水稻稻瘟病菌和火龙果溃疡病菌等6株植物病原真菌的抑制率均在30.00%以上,表现出较好的抗菌活性。结合形态特征与18S rDNA序列分析鉴定,确定菌株M4为Phanerochaete sp.,其菌株发酵液在20 mg/mL浓度下对马铃薯黄萎病大丽轮枝菌、马铃薯黑白轮枝菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、西瓜枯萎病菌、马铃薯立枯丝核菌和香蕉枯萎病4号小种等7株病菌均具有一定的抑制作用,其中对禾谷镰刀菌的抑制效果最佳,抑制率为40.92%,显著高于对其他病原菌的抑制率(P<0.05)。【结论】山橙内生真菌富含抑菌活性菌株,蕴藏着潜在的抑菌活性物质,具有良好的应用前景。

关键词: 山橙;内生真菌;植物病原真菌;生物活性

中图分类号: S482.292                            文献标志码: A 文章编号:2095-1191(2020)09-2152-08

Antifungal activity of endophytic fungi in Melodinus suaveolens Champ. ex Benth

CHEN Lin1,2, HUANG Yan1, HE Bo1, LIN Zhang-xing1, ZENG Dong-qiang1,

TANG Wen-wei1*

(1College of Agriculture,  Guangxi University, Nanning  530004, China; 2Hengyang Academy of Vegetable Research,Hengyang, Hunan  421000, China)

Abstract:【Objective】Endophytic fungi with antifungi activity were isolated from Melodinus suaveolens Champ. ex Benth to explore its potential active substances, and it provides a reference for  development of new high-efficiency biopesticides. 【Method】Tissue culture method was used to isolate and purify the endophytic fungi from M. suaveolens, and the endophytic fungi were identified by morphological analysis and 18S rDNA gene sequence comparison. The antifungal activities of the fungi against 13 species of plant pathogenic fungi such as Fusarium oxysporum f.sp.cubense special Race 4, Colletotrichum musae Berk. et Curt and Neocystidium dimidiatum(Penz.) Crous & Slippers  were determined by plate confrontation and growth rate method. 【Result】Twenty endophytic fungi were isolated from the roots, branches and leaves of M. suaveolens. Among them, M4 strain had above 30.00% inhibition rate against Coniothyrium diplodiella, Plasmopara halstedii(Farl.) Berl. and Fusarium graminearum Schwabe,Verticillium dahliae,Pyricularia grisea(Cooke) Sacc and N. dimidiatum, showing fine antifungal activities. Combined with morphological characteristics and 18S rDNA sequence analysis, the strain M4 strain was identified as Phanerochaete sp., which had inhibition effects on Verticillium dahliae Kleb, V. albo-atrum, F. graminearum Schwabe, V. dahliae, F. oxysporum f. sp. nibeum, Rhizoctonia solanikuhn and Fusarium oxysporum f. sp. cubense special Race 4 at the concentration of 20 mg/mL of fermentation broth. The inhibition effects on F. graminearum were the best and the inhibition rate was 40.92%, which was significantly higher than  inhibition rates on other fungi(P<0.05). 【Conclusion】M. suaveolens endophytic fungi contain antifungal strains, potential antifungal active substances and good promise for application.

Key words: Melodinus suaveolens Champ. ex Benth; endophytic fungi; plant pathogen fungi; bioactivity

Foundation item: National Natural Science Foundation of China(31660529); Key Project of Guangxi Natural Science Foundation(2017GXNSFDA198049)

0 引言

【研究意義】目前,由植物病原菌侵染引起的植物病害主要采用化学农药进行防治,但由于农药的过多使用,导致环境污染和病原菌抗药性等问题日益严重(Niu et al.,2014)。因此,寻找具有抗菌活性的微生物资源显得尤为重要(Katoch et al.,2017)。植物内生菌是一种在整个或部分生命过程中生活在健康植物内部组织和各器官中,并且不会对宿主造成明显有害影响的微生物群体(Sturz et al.,2000;Bressan and Borges,2004),主要包括放线菌、真菌及细菌。近年来,随着人们对植物内生菌的深入研究,国内外研究人员从植物中分离出内生菌并将其应用于农业领域来防治植物病害,为防治植物病原菌提供了一条新途径(Koulman et al.,2007;Ting et al.,2010;Zachow et al.,2015)。【前人研究进展】目前国内外对植物内生真菌的抑菌活性研究较多。Wiyakrutta等(2004)从泰国多种药用植物中分离得到多株具有抗菌、抗癌和抗疟疾活性的内生真菌,使内生真菌的研究意义进一步得到体现,也为天然药物筛选提供了一条新思路。王晓鹏等(2006)采用组织培养法从桃儿七中分离得到35株内生真菌,生物活性测定显示其内生真菌次生代谢产物发酵液具有良好的抑菌活性及杀虫活性。蔡永欢(2010)对喜树(Camptotheca acuminata Decne.)内生真菌进行了抑菌活性测定,筛选得到1株具有良好活性的菌株。梁子宁等(2014)采用组织匀浆法对鸦胆子进行分离得到85株内生细菌,筛选得到1株抑菌活性显著的菌株。Li等(2016)从花椒中分离出940株内生真菌,筛选出8株内生真菌对宿主病原真菌Fusarium sambucinum和Pseudocercospora zanthoxyli有较强的持久抑制作用。林长幸(2018)采用组织培养法从狭叶坡垒中分离出8株内生真菌,抑菌活性测定结果显示其内生真菌具有显著活性。庄华和岳海梅(2018)对砂生槐内生真菌的抑菌活性进行测定,结果得到1株具有良好抑菌活性的菌株。Tan等(2018)从八角莲各组织中分离筛选出多株内生真菌,并证明分离获得的菌株具有良好的抗菌和抗肿瘤活性,这些活性菌株可用于研制开发新型天然抗菌剂或抗癌剂。颜桢灵等(2019)的研究结果表明,血散薯茎叶中存在丰富的内生真菌资源,且其次生代谢产物具有广谱抗菌活性。【本研究切入点】山橙(Melodinus suaveolens Champ. ex Benth)为夹竹桃科(Apocynaceae)山橙属(Melodinus)植物(Aksoy and Unal,2008;Katoch et al.,2017),产于广西十万大山和大青山,其植物为珍稀林木,具有重要的科研价值。本课题组前期研究对山橙进行了系统成分分离,得到一系列具有抑菌活性的化合物(许亚楠,2016)。目前,从山橙中分离对植物病原真菌具有拮抗活性的内生真菌研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用组织培养法对山橙内生真菌进行分离,结合菌种形态学和18S rDNA序列比对对内生真菌进行鉴定,再通过平板对峙法和菌丝生长速率法对内生真菌进行抑菌活性筛选,旨在筛选出对植物病原真菌具有显著抑菌活性的山橙内生真菌,为研发新型高效生物农药提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试植物 供试山橙为无明显病虫害的多年生植株,于2017年5月采自广西十万大山,其材料标本存放于广西大学农学院农药与环境毒理研究所。

1. 1. 2 供试病原真菌 供试植物病原真菌13株,分别为:火龙果溃疡病菌[Neoscytalidium dimidiatum(Penz.) Crous & Slippers]、香蕉枯萎病4号小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical Race 4)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae Berk. et Curt)、水稻稻瘟病菌[Pyricularia grisea(Cooke) Sacc]、马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctonia solanikuhn)、向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、马铃薯黄萎病大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)、白腐盾壳霉菌(Coniothyrium diplodiella)、马铃薯黑白轮枝菌(V. albo-atrum)、禾谷镰刀菌(F. graminearum Schwabe)、向日葵霜霉病菌[Plasmopara halstedii(Farl.) Berl. et de Toni]、茄子黄萎病菌(V. dahliae)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. nibeum),均由广西大学农学院植物病理研究室提供。

1. 1. 3 供试试剂 马铃薯葡萄糖培养基:固体(PDA)和液体(PDB)培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。DNA提取试剂盒(Fungus DNA Isolation Kit,Cat.No.LB1235)、2×Pfu PCR预混液(2×Pfu PCR Mix,Cat.No.LB2003)、DNA-Marker和Taq PCR StarMax试剂(北京康润诚业生物科技有限公司);ddH2O(Genstar公司);PCR所需引物:ITS1:5'-TCC GTAGGTGAACCTGCGG-3',ITS4:5'-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3')[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 内生真菌分离与纯化 样品通过前处理筛选出健康饱满的植物组织(Clay et al.,2005),先用75% CH3CH2OH消毒2 min(其中根部组织5 min),无菌水清洗2~3次,然后用2% NaClO溶液消毒1 min(其中根部组织3 min),再用75% CH3CH2OH浸泡1 min(其中根部组织3 min),无菌水漂洗2~3遍,用已灭菌的滤纸吸干组织表层水分,阴干备用。在无菌条件下采用组织块培养法(针对根)和组织片培养法(针对枝和叶片)(张弘弛,2012)将植物材料剪成5 mm×5 mm大小的组织接种至PDA培养基中生长,再采用平板划线法对其菌株进行纯化,将其纯化的PDA培养基置于28 ℃恒温箱中培养,镜检观察培养基上新长出菌落的外部形态一致即为纯菌落。

1. 2. 2 内生真菌鉴定 将已纯化的菌株接种至PDB培养液中培养3~5 d后,将菌株发酵液离心收集其菌丝体,按照CTAB法(Ceren et al.,2015)提取真菌DNA。PCR反应体系50.0 ?L:DNA 模板1.0 ?L,10×Buffer(MgCl2)5.0 ?L,dNTP 3.0 ?L,Taq Polymerase 0.5 ?L,上、下游引物各1.0 ?L,ddH2O 38.5 ?L。扩增程序:94 ℃预变性5 min;93 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,进行40次循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。在NCBI数据库中进行18S rDNA BLAST比对分析,确定真菌的归属。

1. 2. 3 内生真菌抑菌活性测定 采用平板对峙法(Han et al.,2018)筛选对植物病原真菌具有良好拮抗效应的内生真菌:将供试病原真菌和内生真菌菌饼接种至同一个PDA培养基中,以仅接种病原真菌的培养基作对照,再将含菌培养基置于28 ℃恒温箱中培养3~5 d,每处理3~5次重复,根据病原真菌和内生真菌菌落直径大小结合空白病原真菌菌落直径大小筛选拮抗效应显著的内生真菌菌株。

采用菌丝生长速率法(Stinson et al.,2003;黄桂荣等,2005)测定内生真菌菌株发酵液对植物病原真菌的抑菌效果:将内生真菌菌株接种至PDB培养液中,置于120 r/min摇床中恒温(28 ℃)振荡培养7 d后收集其发酵液,过滤离心清除菌丝体后用0.22 ?m微孔滤膜过滤除菌,得到无菌发酵液备用。

培养基制备:融化PDA,在无菌条件下将2 mL无菌发酵液与8 mL冷却至45 ℃左右的PDA混合均匀,于超净工作台中静置冷却,得到浓度为20 mg/mL的含无菌发酵液培养基,以含相同浓度PDB发酵液的PDA培养基为对照。将6 mm的病原真菌菌饼接种至PDA中,后倒置于28 ℃的恒温培养箱中培养4~5 d,每处理3~5次重复。采用十字交叉法测量培养皿中病原菌的直径以计算其抑制率。抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100。

1. 3 统计分析

菌株测序结果用DNAMAN 6.0进行序列拼接,然后通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序与GenBank核酸数据库进行比对,再利用Sequin 9.20上传至GenBank数据库,获得Accession Number。试验数据采用Excel 2003和SPSS 22.0进行统计分析。采用邓肯氏新复极差法对试验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 山橙内生真菌鉴定结果

通过组织印迹检查(Clay et al.,2005),在培养皿中未见杂菌长出,证明表面消毒彻底。在NCBI数据库进行相似性比对和形态学鉴定(魏景超,1979),结果(图1)从山橙中共分離纯化出20株内生真菌,其中从根、枝和叶中分别分离得到4、5和11株内生真菌,菌株分别为:Alternaria sp.、Diaporthe sp.、Perenniporia sp.、Phanerochaete sp.、Guignardia sp.、Nigrospora sp.、Arthrinium sp.、Colletotrichum sp.、Stemphylium sp.、Gloeophyllum sp.、Coriolopsis sp.、Microthyriaceae、Cercospora sp.、Diaporthe sp.、Corticiaceae、Aspergillus sp.、Earliella sp.、Sordariomycetes、Helotiales和Dothideomycetes(表1)。

2. 2 山橙内生真菌的形态学特征

结合《真菌鉴定手册》(魏景超,1979)对20株内生真菌菌株菌落形态特征(包括菌落颜色和菌丝形态等)和DNA测序结果进行菌株鉴定。由图1和表2可知,20株山橙内生真菌的生长特性各不相同,菌株的菌丝颜色与菌落形态也千差万别,其中M1和M2菌落颜色为灰褐色,M3、M4、M6、M11、M14、M15和M17菌落为白色,M5、M13和M20菌落为黑褐色,M7、M8、M12和M18菌落为灰色,M9菌落为黄褐色,M10菌落为橙色,M16菌落为黄绿色,M19菌落为橙黄色。

2. 3 山橙内生真菌对13株植物病原真菌的活性

采用平板对峙法测定20株内生真菌对供试13株植物病原真菌的抑菌活性,结果(表3)显示,M1、M2、M3、M4、M16和M19对部分病原真菌的抑菌率在30.00%以上,其中M2和M4对部分病原真菌的抑菌率高于50.00%。综合表3结果,M4菌株的抑菌效果明显,具有进一步研究的价值。

2. 4 菌株M4发酵液对13株植物病原真菌的抑菌活性

为进一步探究抑菌活性良好菌株M4(Phanerochaete sp.)发酵液次生代谢产物的抑菌活性,在20 mg/mL浓度下采用菌丝生长速率法测定其对13株常见植物病原真菌的抑菌活性,结果(图2)显示,M4菌株发酵液对马铃薯黄萎病大丽轮枝菌、马铃薯黑白轮枝菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、西瓜枯萎病菌、马铃薯立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌4号小种等7株病菌均具有一定的抑制作用,其抑制率分别为7.48%、15.65%、40.92%、12.69%、28.75%、21.21%和8.79%,其中对禾谷镰刀菌的抑制作用最大,显著高于对其他病原菌的抑制率(P<0.05)。

3 讨论

植物内生真菌于1898年首次从黑麦草种子中被发现,从而开启了内生真菌的新纪元(任燕,2018);1994年,邱德有等发表的关于通过组织培养法对云南红豆杉进行内生真菌分离的报道开启了内生真菌分离手段的新起源,且此方法一直沿用至今。蔡永欢(2010)对喜树进行内生真菌的分离时将枝条和根韧皮部切去再切成5 mm×5 mm小块,种子切成5 mm×10 mm组织块,叶片切成5 mm×5 mm组织片,消毒6~8 min,共分离得到28株内生真菌;王丽薇(2011)将天南星(Arisaema heterophyllum Blume)、多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)、银杏(Ginkgo biloba L.)、无花果(Ficus carica Linn.)、博落回[Macleaya cordata(Willd.) R. Br.]、马兰[Kalimeris indica(Linn.) Sch.]等6种植物组织材料切成10 mm×10 mm大小,消毒处理11 min,共分离得到112株内生真菌;张弘弛(2012)对杜仲(Eucommia ulmoides)和无花果(Ficus carica Linn.)进行内生真菌的分离时将组织材料切成5 mm×5 mm大小,其根部消毒时间少于10 min,共分离得到119株内生真菌。由此可见,组织培养法分离内生真菌时消毒不彻底会影响分离结果的准确性,而消毒时间过长则有可能杀死组织内部的微生物,不同植物体内分离到的内生真菌种类和数量会有一定差异(邹文欣和谭仁祥,2001),造成这种差别还可能与植物种类、植物生境、植物体内微环境及所取组织部位等因素有关(毕江涛等,2012)。本研究从山橙中共分离得到20株内生真菌,其不同组织部位分离得到的内生真菌数量存在一定差异,分布特点为根、枝、叶中内生真菌数量递增,且分离得到的内生真菌菌株数量相比其他植物少,可能是试验过程中为了确保分离菌株的内生性,其根部消毒了11 min,枝和叶组织分别消毒了4 min,因消毒时间过长,造成部分内生真菌被杀死。

内生真菌种类多样,功能也多样(黄桂荣等,2005;乔云明,2016),即使是同一菌株对不同病原真菌的抑菌活性也可能存在差异;同时,内生真菌的菌丝体与发酵液活性会有差异,平板对峙法初步筛选活性菌株具有直观、简便、成本低的优点,是一种体外有效筛选活性内生真菌的方法,但平板对峙法中内生真菌可能与供试指示菌的生长速度不同,容易造成彼此之间的干扰,选择发酵液以菌丝生长速率法进行活性检测,可进一步实现抑菌活性高效筛选(毕江涛等,2012)。刘霞等(2010)采用菌丝生长速率法发现甘草(Glycyrrhiza uralensis)内生菌Z4发酵液对苹果干腐病菌和烟草赤星病菌的抑制效果显著;王艳红等(2012)采用平板对峙法研究药用植物温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)中内生真菌对几种常见植物病原菌的拮抗作用时,发现 Chaetomium globosum L18对番茄灰霉病菌的抑制效果不明显,但对玉米弯孢叶斑病菌的抑制效果显著。本研究中平板对峙法测定同样发现菌株M4对马铃薯黄萎病大丽轮枝菌无抑菌效果,但对水稻稻瘟病菌的抑制效果显著,而进一步利用菌丝生长速率法发现其菌株发酵液对禾谷镰刀菌也具有较好的抑菌效果,因此,本研究综合使用平板对峙法和菌丝生长速率法测定山橙内生真菌对植物病原真菌的抑菌活性,对内生菌的活性评价较全面。

4 结论

从药用植物山橙中分离纯化得到20株内生真菌,经筛选得到1株抑菌活性较高的菌株M4(Phanerochaete sp.),该菌株对禾谷镰刀菌等植物病原真菌具有较好的抑菌效果。表明山橙内生真菌富含抑菌活性菌株,蕴藏着潜在的抑菌活性物质,具有良好的应用前景。

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(責任编辑 麻小燕)

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