EBAG9/RCAS1与肿瘤的关系及其免疫逃避机制的研究进展

景敏洁，兰丽珍

(山西医科大学第一医院内分泌科，太原 030001)

虽然机体的免疫系统具有免疫监视、防御、清除的作用，但肿瘤仍会对人类机体造成严重破坏。研究证明，肿瘤不仅是癌基因、抑癌基因突变以及异常细胞过度增生的结果，也是一种系统性疾病，机体免疫系统及其微环境在肿瘤发生、进展过程中有着不容忽视的作用[1-3]。肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统的识别和攻击，包括肿瘤抗原识别分子机制、肿瘤抵抗凋亡机制以及肿瘤抑制性分子机制等。目前肿瘤患者主要接受手术、放疗、化疗等多学科治疗，但对晚期或复发性肿瘤的抗癌治疗具有一定局限性，迫切需要开发新的治疗方法以改善患者的生活质量，而肿瘤的免疫治疗在肿瘤临床治疗中具有很大潜能。肿瘤细胞通过表达雌激素受体结合片段相关抗原9(estrogen receptor-binding fragment-associated antigen 9，EBAG9)/SiSo细胞上表达的受体结合型肿瘤相关抗原(receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells，RCAS1)与表达相应受体(即EBAG9/RCAS1受体)的免疫细胞结合，使免疫细胞无法监视和清除肿瘤细胞。现就EBAG9/RCAS1与肿瘤的关系及其免疫逃避机制的研究进展予以综述。

1 EBAG9和RCAS1

RCAS1最初被小鼠单克隆抗体22-1-1识别，该单克隆抗体是通过利用人子宫颈腺癌细胞系SiSo免疫小鼠产生，因此又可称为22-1-1抗原[4]。EBAG9由Watanabe等[5]从人乳腺癌MCF-7细胞的互补DNA文库中分离得到，位于染色体8q23，其启动子上游区域包含雌激素反应元件，而雌激素可增强其转录活性。Nakashima等[6]发现，RCAS1和EBAG9是同一种蛋白质，且RCAS1是一种Ⅱ型跨膜蛋白，其C端的第179～206个氨基酸构成了螺旋-螺旋结构，位于细胞膜外，N端的第8～27个氨基酸构成了跨膜结构，位于细胞质。Maeyama等[7]研究了过表达全长EBAG9或截断EBAG9(即缺失35个C端最末端的氨基酸)在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠体内肿瘤的生长情况，结果发现，在过表达全长EBAG9组中，所有接种小鼠的肿瘤生长均显著加速，而在截断EBAG9组中，肿瘤未见生长。可见，EBAG9的卷曲螺旋结构在促进肿瘤生长中具有重要作用。

2 EBAG9/RCAS1与肿瘤的关系

2.1肿瘤细胞中EBAG9/RCAS1的表达 EBAG9/RCAS1可表达于多种恶性肿瘤细胞中，如乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、宫颈癌[10]、胆管癌[11]、膀胱癌[12]、甲状腺癌[13]等。王逸君等[11]研究发现，与正常胆管组织相比，胆管癌组织中EBAG9/RCAS1的表达增加，且与不良的病理特征(如TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移)相关。在食管鳞状细胞癌中也发现了EBAG9/RCAS1的表达较正常食管黏膜组织增加，提示EBAG9/RCAS1与癌症的发生密切相关，并与癌细胞的低分化性、侵袭性以及淋巴结转移相关[14]。Ito等[15]发现，未分化型甲状腺癌组织中RCAS1的表达水平显著高于分化型甲状腺癌(乳头状癌和滤泡状癌)组织，故认为RCAS1的表达与肿瘤的分化程度相关。鲁笑钦等[10]发现，与宫颈良性病变组织相比，宫颈癌组织中RCAS1的表达显著增加，且低分化宫颈癌组织中RCAS1的表达水平显著高于中分化及高分化宫颈癌组织，表明RCAS1的表达与肿瘤的恶性程度及分化程度相关。Miyazaki等[16]将MB-49细胞(膀胱癌细胞)接种在EBAG9基因敲除小鼠和EBAG9阳性小鼠中发现，EBAG9基因敲除小鼠的膀胱癌灶体积显著小于对照小鼠，且肺转移灶显著少于对照小鼠，表明EBAG9参与了肿瘤的生长和转移。Giaginis等[17]研究表明，胃癌组织中RCAS1的高表达与组织病理分期及远处转移显著相关，且高表达RCAS1胃癌患者的生存期显著短于低表达RCAS1的患者。另有研究发现，肿瘤细胞中EBAG9/RCAS1的高表达与生存期缩短及不良预后相关[18-19]。可见，EBAG9/RCAS1不仅与肿瘤的发生密切相关，还与肿瘤的恶性程度及侵袭性特征相关，如临床分期、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移等，同时也与患者的不良预后显著相关。但有研究者认为，肿瘤细胞中EBAG9/RCAS1的高表达与肿瘤大小及淋巴结转移无关[8]。

EBAG9/RCAS1是一种跨膜蛋白，在肿瘤细胞质和细胞膜中均有表达。Ito等[15]发现，未分化型甲状腺癌中RCAS1的表达主要定位于细胞膜上，而高分化型乳头状癌主要定位于细胞质中，推测RCAS1的表达模式与肿瘤的恶性程度相关。Szubert等[9]采用免疫组织化学方法分析卵巢癌细胞RCAS1的表达，结果发现，卵巢癌细胞质中RCAS1高表达的患者较RCAS1低表达患者的总生存期缩短2倍以上，且癌细胞中的膜状RCAS1不会影响患者的生存。可见，EBAG9/RCAS1在肿瘤细胞中的表达模式不同，生物学功能也不相同。

2.2可溶性EBAG9/RCAS1的表达 EBAG9/RCAS1还存在一种可溶性形式，可以在血清及胸腔积液中检测到。Dong等[20]研究发现，恶性胸腔积液中RCAS1的水平显著高于良性胸腔积液，且在最佳临界值为7.326 U/mL时，胸腔积液RCAS1诊断的灵敏度和特异度分别为67.92%和81.63%；而Xu等[21]认为，当可溶性RCAS1的临界值为9.7 U/mL时，鉴别良恶性胸腔积液的灵敏度为83.3%，特异度为91.4%，且联合检测胸腔积液RCAS1和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)可以提高诊断的特异度和灵敏度。王雷和郝炯[22]发现，与结核性胸腔积液相比，恶性胸腔积液中RCAS1的表达显著增加，且RCAS1的表达量与癌细胞增殖活性相关基因以及侵袭性相关基因的表达量直接相关，故认为RCAS1可作为鉴别胸腔积液恶性程度的可靠指标。因此，胸腔积液RCAS1可用于鉴别胸腔积液的良恶性，联合CEA将提高诊断的特异度和灵敏度。

Han等[23]研究发现，结直肠癌患者中血清RCAS1的阳性率为82.1%，高于CEA；在CEA阴性病例中，RCAS1的灵敏度为88.2%；随访结直肠癌治疗后的患者发现，血清RCAS1水平显著降低，而复发结直肠癌患者的血清RCAS1水平显著升高。故认为，血清RCAS1不仅可用于诊断，还可用于监测肿瘤复发。Szubert等[24]研究发现，子宫内膜癌患者手术治疗后血清可溶性RCAS1水平显著低于治疗前；通过单因素分析发现，术前和术后可溶性RCAS1水平与子宫内膜癌患者总生存期有关，多因素分析显示，术后高可溶性RCAS1水平是子宫内膜癌总生存期缩短的独立预后因素，但术前与术后可溶性RCAS1水平的差异并不影响患者的总生存期，因此血清RCAS1可用于评估治疗效果，且术后可溶性RCAS1水平与不良预后相关。Xu等[25]认为，对于非小细胞肺癌患者，当血清RCAS1的临界值为19.8 U/mL时，灵敏度为87.6%，特异度为82.5%，准确率为86.1%；单因素分析显示，血清RCAS1水平升高的非小细胞肺癌患者总生存期显著短于良性肺疾病及健康者；而多因素分析认为，可溶性RCAS1是独立的预后因素，表明可溶性EBAG9/RCAS1是癌症有价值的生物标志物，可用于协助诊断、评估治疗效果、监测疾病复发以及预测不良预后。因此，作为临床指标，可溶性EBAG9/RCAS1较膜分子EBAG9/RCAS1更为有价值，因为血液及胸腔积液在临床上很容易采样。

2.3肿瘤基质细胞中EBAG9/RCAS1的表达 肿瘤微环境不仅包括肿瘤细胞本身，还包括肿瘤基质细胞、细胞因子等，与肿瘤发生、生长及转移密切相关[26]。然而，在许多浸润肿瘤基质的非癌细胞上也发现了EBAG9/RCAS1的表达，如肿瘤相关的巨噬细胞和成纤维细胞[27]。EBAG9/RCAS1可通过巨噬细胞和成纤维细胞对肿瘤基质浸润的影响，参与肿瘤微环境的重塑[9]。Józ＇wicki等[12]研究发现，膀胱癌细胞中RCAS1的表达与肿瘤分期和转移能力有关，与肿瘤分级、组织侵袭类型及非经典分化数无显著相关，但肿瘤微环境中成纤维细胞及巨噬细胞的RCAS1表达与肿瘤分级、组织侵袭类型及非经典分化数均显著相关。另有研究表明，在具有淋巴结转移的卵巢肿瘤中，巨噬细胞和成纤维细胞中RCAS1高表达[28]。可见，肿瘤的侵袭性特征不仅与肿瘤细胞中RCAS1的表达相关，还可能与肿瘤微环境基质细胞中RCAS1的过表达相关。然而，Galazka等[29]证明，RCAS1在宫颈癌基质内巨噬细胞和成纤维细胞中的表达与肿瘤分级无关，不会影响淋巴结转移。Szubert等[9]研究表明，癌细胞质中RCAS1高表达对患者的生存期有影响，但肿瘤相关巨噬细胞和成纤维细胞中的RCAS1表达对患者的生存期无影响。因此，EBAG9/RCAS1在肿瘤相关巨噬细胞和成纤维细胞中表达的临床意义仍需进一步研究。

3 EBAG9/RCAS1逃避免疫系统监视和清除的机制

肿瘤逃避免疫系统的监视和清除是肿瘤发生、发展的重要机制之一[30]，而EBAG9/RCAS1与肿瘤免疫逃避相关。研究者发现，EBAG9/RCAS1过表达可诱导免疫细胞(如T细胞)凋亡[6,31-32]，使肿瘤细胞逃避免疫系统的监视和清除。另外，EBAG9/RCAS1还可通过抑制T细胞的细胞毒性来实现肿瘤免疫逃避。

3.1膜分子形式EBAG9/RCAS1诱导免疫细胞凋亡的可能机制 以往研究表明，免疫细胞(如T、B细胞和自然杀伤细胞)表达RCAS1受体，特别是当这些免疫细胞被激活时，肿瘤细胞中RCAS1与表达相应受体的免疫细胞结合，通过激活白细胞介素-1β转化酶样蛋白酶来抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡性死亡，使肿瘤细胞逃避免疫系统监视而不断发展，且RCAS1通过细胞表面的卷曲螺旋区域与表达RCAS1受体的免疫细胞结合[6]。而Maeyama等[7]发现，EBAG9的卷曲螺旋结构在促进肿瘤生长中有重要作用。由此推测，EBAG9/RCAS1可能通过卷曲螺旋结构与表达相应受体的免疫细胞结合而诱导细胞凋亡，从而逃避机体免疫系统的监视和清扫，促使肿瘤不断生长。此后，不断有学者研究RCAS1诱导细胞表达相应受体以及诱导受体细胞凋亡和生长抑制的可能机制。研究发现，RCAS1过表达可诱导活化的T细胞、白血病细胞系衍生的免疫细胞凋亡；进一步使用谷胱甘肽S-转移酶-RCAS1融合蛋白检测发现，在K562细胞、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激后的Jurkat细胞中表达RCAS1受体，同时发现RCAS1可在体外抑制K562细胞及PHA刺激后的Jurkat细胞的生长，提示RCAS1可能通过与RCAS1受体结合而诱导细胞凋亡；另外，RCAS1抑制细胞生长的机制可能与糖原合酶激酶3β的下调有关[32]。Nishinakagawa等[33]研究发现，RCAS1通过特异性下调细胞周期蛋白D3诱导细胞周期G1期生长停滞；同时，RCAS1可诱导细胞色素C释放并激活胱天蛋白酶(caspase)3，而caspase-8(与死亡受体途径相关)未被激活，由此得出RCAS1通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

3.2EBAG9/RCAS1通过脱落形式诱导免疫细胞凋亡的可能机制 已知，EBAG9/RCAS1存在一种可溶性形式，即膜分子形式的EBAG9/RCAS1经过蛋白水解后胞外域脱落转换成可溶性蛋白，可溶性EBAG9/RCAS1也参与诱导免疫细胞的凋亡[34]。Sonoda和Kato[35]通过微阵列分析发现，与MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)相比，解整合素金属蛋白酶9(recombinant A disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)在SiSo细胞中的表达水平显著升高，且没有发现其他强表达信号的蛋白酶在SiSo细胞与MCF-7细胞之间呈现显著差异；进一步研究发现，用ADAM9小干扰RNA转染的SiSo细胞表面显示出ADAM9表达受到抑制，并显示出RCAS1表达增加，而培养的上清液中RCAS1的表达量显著降低；另一方面，用ADAM9互补DNA转染的细胞表面显示出ADAM9表达上调，而RCAS1表达显著减少，故认为ADAM9加速了RCAS1的脱落；同时发现，47例宫颈癌和48例子宫内膜癌患者的血清RCAS1水平均以依赖RCAS1和ADAM9表达的方式而升高或降低，这些结果进一步支持ADAM9参与人宫颈癌中RCAS1脱落，且脱落的RCAS1诱导了K562细胞的凋亡。综上可知，RCAS1主要通过脱落形式诱导表达RCAS1受体的细胞凋亡，而ADAM9参与了RCAS1胞外域的脱落。

3.3EBAG9/RCAS1抑制免疫细胞毒性的可能机制 T淋巴细胞的细胞毒活性对于免疫监测和体内平衡至关重要，通过与靶细胞接触产生脱颗粒，使包括穿孔素和颗粒酶在内的颗粒成分进入靶细胞导致其死亡。Miyazaki等[16]发现，与EBAG9阳性膀胱癌小鼠相比，EBAG9基因敲除膀胱癌小鼠中浸润的CD8+、CD3+和CD4+T细胞数量显著增加，而将EBAG9基因敲除小鼠的CD8+T细胞转移至野生型膀胱癌小鼠后，显著抑制了肿瘤的生长，由此认为EBAG9通过参与抑制CD8+T细胞的细胞毒性，从而逃避免疫系统的监视和清除；成熟CD8+T细胞的脱粒是穿孔素和颗粒酶介导的靶细胞杀伤的必要过程，EBAG9的缺失增加了CD8+T细胞中脱粒标志物CD107(一种与细胞脱粒相关的蛋白)的表达，这表明EBAG9参与肿瘤浸润性T细胞中溶解颗粒内体运输的调节；同时他们还发现，EBAG9基因敲除组小鼠中白细胞介素-10受体的表达水平高于对照组。而白细胞介素-10可诱导CD8+T细胞的增殖和细胞毒性，发挥抗肿瘤的作用[36]。这些结果表明，EBAG9可负调节CD8+T细胞的细胞毒性，而EBAG9功能的丧失激活了白细胞介素-10/白细胞介素-10受体的信号转导。

EBAG9过表达可能通过产生与肿瘤相关的O-连接的聚糖Tn抗原(如22.1.1抗原)来促进肿瘤细胞的抗原性[37]。研究表明，肿瘤细胞通常会分泌大量细胞外囊泡(包括外泌体)到其微环境中，起细胞间通讯及分子转移的介质作用，在肿瘤的发展和转移中有重要作用[38-39]。Miyazaki等[40]研究发现，EBAG9过表达的前列腺癌来源的细胞外囊泡中含有EBAG9蛋白，而EBAG9蛋白抑制了T细胞的细胞毒性，并下调了免疫相关基因(如γ干扰素、白细胞介素-10受体、颗粒酶B以及CXC趋化因子受体3)的表达，从而达到肿瘤免疫逃避的目的。此外，核因子κB信号转导通路在肿瘤来源的细胞外囊泡调节肿瘤微环境中也起重要作用[41]。

4 小 结

目前，有几种治疗策略可抑制EBAG9/RCAS1的表达和功能。第一种治疗策略是使用小干扰RNA干扰RCAS1的表达，在肿瘤细胞中诱导特异性小干扰RNA可减少T淋巴细胞凋亡，使肿瘤消退[42-43]；第二种治疗策略是阻断EBAG9/RCAS1诱导免疫细胞生长抑制或凋亡所参与的可能信号通路，即干预细胞周期D3蛋白的表达或采用caspase抑制剂阻断线粒体通路，从而抑制EBAG9/RCAS1诱导免疫细胞生长抑制或凋亡；第三种治疗策略是阻断ADAM9介导的EBAG9/RCAS1胞外域脱落，但这一机制尚需进一步证实。因此，研究EBAG9/RCAS1参与逃避免疫系统的具体机制对癌症治疗的新策略有重要作用，但目前确切机制尚不明确需进一步研究。