5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人子宫内膜样癌JEC细胞中P57kip2蛋白表达及细胞形态影响的研究

周 俊，王凤月，李三华，钟 栎，赵 朔，刘俊江，张春英，周正平

(遵义医科大学1.病理学教研室；2.电镜室；3.医学与生物学研究中心；贵州 遵义 563099)

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其主要组织学类型是子宫内膜样癌(Endometrial carcinoma,EC)。2018年国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC) 统计，全球约有382 069例新发子宫内膜癌患者，有89 929例患者死亡，其高发病率和高死亡率严重威胁着女性健康。目前研究发现，无孕激素拮抗的高水平雌激素刺激、肥胖、高血压、糖尿病、不孕、绝经期晚等均为子宫内膜癌的高危因素。但导致子宫内膜癌发生发展的确切机制尚不清楚,可能还与基因突变、翻译后修饰等有关[1-3]。

p57kip2是最迟被发现的细胞周期调控抑制因子，能广泛抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 (Cyclin-dependent kinase,CDK)的激酶活性，使细胞无法从G1期转变到S期，起到负性调控细胞周期的作用[4]。目前研究发现，在多种肿瘤组织中，P57kip2蛋白水平的异常表达可能与表观遗传修饰有关[5]。DNA甲基化是基因表观遗传修饰的重要方式，主要发生于基因启动子区CpG岛，在不改变DNA碱基序列的前提下，通过甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用，使CpG岛5’端的胞嘧啶变成5’甲基胞嘧啶(5-mc)，从而改变肿瘤细胞的表型，进而影响肿瘤相关基因的表达[6]。5-Aza-CdR是一种DNMT抑制剂，可使DNMT失活，从而使高甲基化状态的肿瘤抑制基因启动子区DNA去甲基化，激活肿瘤抑制基因，使其重新恢复表达，发挥其抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞分化的功能[7]。本实验拟选用人EC的中分化JEC细胞，明确细胞中p57kip2基因变异情况；用5-Aza-CdR干扰后，检测JEC细胞中p57kip2基因启动子区甲基化水平及其蛋白表达情况、细胞生长及细胞形态变化，探讨p57kip2对子宫内膜癌增殖、分化的的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 中分化人EC JEC细胞株由遵义医科大学微生物教研室提供。

1.2 试剂与仪器 5-Aza-CdR购自MACKLIN公司，MTT 相关试剂购自南京凯基公司，WB相关试剂均购自上海碧云天生物研究所，p57kip2兔抗人单克隆抗体、二抗山羊抗兔抗体购自Abcam公司，RPMI 1640培养基、南美胎牛血清购自美国Gibco公司。CO2细胞培养箱、酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，倒置显微镜DM4000B (日本OLYMPUS公司)，透射电子显微镜H-7650(日本日立公司)，扫描电子显微镜FE-SEM SU8010(日本日立公司)，Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。Sanger测序、BSP检测均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 Sanger测序法检测p57kip2基因外显子是否存在突变 取对数生长期细胞，消化离心后送生工生物工程(上海)股份有限公司检测。引物设计：F,5′-CCGTGGTGTTGTTGAAACTGAA-3'，R,5' GTCCACTGCAGGCGTCCA-3'，636 bp。采用PCR仪分别对p57kip2基因进行扩增。PCR 50 μL反应体系：模板1 μL，引物Fi 1 μL，引物Ri 1 μL，dNTP10 mmol/L 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，水35.5 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s，72 ℃修复延伸5～8 min，上述条件循环35次后1%琼脂糖及150 V、100 mA 20 min电泳后使用Sanger测序法检测p57kip2基因外显子区域，即对突变位点进行PCR扩增后进行测序验证测序。

1.3.2 BSP法检测JEC细胞中p57kip2基因启动子区甲基化情况 结合查阅相关文献[8-9]，5-Aza-CdR浓度以10 μmol/L为参考设置浓度梯度(0、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L)，用等量含药培养基干扰JEC细胞24 h，交由生工生物工程(上海)股份有限公司提取DNA进行BSP检测p57kip2基因启动子区32个CpG位点的甲基化情况。引物设计，F,5′-GTTAGTAGGTGTGTGAGGGTTTTAG-3′，R,5′-CTCCTTTATCTACAAACRAAAACCTC-3′，298 bp。PCR反应条件:95 ℃预变性3～5 min，94 ℃变性30 s，55～60 ℃变性25～30 s，72 ℃退火30～50 s，上述条件循环35次，最后72 ℃修复延伸5～8 min后测序。

1.3.3 细胞培养及实验分组 将RPMI 1640培养基、南美胎牛血清和100 U/mL双抗按90%、10%和1%的比列配制成完全培养基，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下体外培养人EC JEC细胞。根据BSP检测结果，选择甲基化率下降明显的两个5-Aza-CdR浓度(12.5 μmol/L 和15 μmol/L)的培养基体外培养JEC细胞作为实验组，等量完全培养基培养作为对照组。

1.3.4 MTT法检测JEC细胞增殖 取对数生长期细胞制成1×105个/mL的单细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板上，待细胞贴壁后，将实验组和对照组分别培养24、48、72 h后，PBS冲洗每孔，加20 μL、5 mg/mL MTT溶液，至孵箱反应4 h后吸出MTT溶液，加100 μL/孔二甲基亚砜( DMSO)，避光震荡10 min，用酶标仪于波长490 nm处检测各组的吸光光度值(OD值) 。

1.3.5 光镜、电镜观察JEC细胞形态结构变化

1.3.5.1 倒置显微镜观察JEC细胞生长情况 取对数生长期细胞制备成1×106个/mL的单细胞悬液，按接种于6孔板上，待细胞贴壁，将实验组和对照组分别培养72 h后于倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况。

1.3.5.2 电镜观察JEC细胞超微结构 将实验组和对照组JEC细胞分别培养72 h后，消化、离心，将细胞团块进行两次固定、梯度脱水。浸透、包埋、聚合，半薄切片定位、超薄切片、双重染色后于透射电镜(Transmittance Electron Microscopy,TEM)下观察细胞内部超微结构；临界点干燥，粘托，镀膜后于扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)下观察细胞表面超微结构。

1.3.6 Western blot法检测JEC细胞中P57kip2蛋白表达 将实验组和对照组分别培养24 h、72 h，加裂解液置冰上裂解30 min，提取蛋白后用BCA法测蛋白浓度，根据试剂说明书配置合适的分离胶和浓缩胶，5×上样缓冲液:蛋白按1∶4的比例混匀后沸水煮3～5 min，进行上样、电泳，切下p57kip2蛋白分子量大小所在区域的凝胶转膜、封闭，一抗(稀释相应倍数的β-actin、p57kip2兔抗人单克隆抗体)4 ℃摇床孵育过夜，洗膜3次，二抗(稀释相应倍数的山羊抗鼠抗体)室温摇床孵育2 h，洗膜3次，于Odyssey系统扫描成像，检测目的蛋白的相对含量(P57kip2蛋白灰度值/β-actin灰度值)。

2 结果

2.1 JEC细胞中p57kip2基因突变情况 在JEC细胞中，p57kip2基因外显子组测序对比后结果显示无突变(见图1)。

图1 p57kip2基因外显子测序峰图

2.2 JEC细胞中p57kip2基因启动子区甲基化水平 在JEC细胞中，p57kip2基因启动子区呈高甲基化状态(见图2)，经各浓度5-Aza-CdR(5、7.5、10、12.5、15 μmol/L)干扰24 h后，其总体甲基化率(分别为88.1%、83.8%、85.8%、76.2%、83.1%)均低于0 μmol/L(88.8%)，其中12.5 μmol/L组(76.2%)、15 μmol/L组(83.1%)的p57kip2基因部分位点去甲基化效果显著，总体甲基化率下降明显。和对照组比较，12.5 μmol/L组总体甲基化水平下降最明显。

2.3 5-Aza-CdR干扰后，JEC细胞的生长情况 相同作用时间：和对照组比较，12.5 μmol/L组细胞生长水平在24、48 h被明显抑制(P<0.05)，72 h抑制不明显(P>0.05)；15 μmol/L组在48 h明显抑制(P<0.05)，24 h和72 h抑制不明显(P>0.05)；在24、48 h，12.5 μmol/L组细胞生长水平均明显低于15 μmol/L组(P<0.05)，在72 h两实验组之间则无明显差异(P>0.05)(见图3)。

相同药物浓度：随着5-Aza-CdR作用时间的延长，对照组和实验组细胞生长水平呈上升趋势。和24 h比较，12.5 μmol/L组在48 h和72 h上升均较为平缓(P>0.05)；15 μmol/L组在48 h上升较平缓(P>0.05)，72 h则明显上升(P<0.05)(见图3)。

2.4 5-Aza-CdR干扰后，JEC细胞中P57kip2蛋白的表达情况 相同作用时间：和对照组比较，在24 h，P57kip2蛋白在两实验组的表达均有所上调，且12.5 μmol/L组上调水平高于15 μmol/L组(P<0.05)，但仅在12.5 μmol/L组的表达上调有意义(P<0.05)；在72 h两个实验组均无明显上调，两实验组之间比较亦无明显差异(P>0.05，见表1，图4)。

相同药物浓度：随着时间延长，P57kip2蛋白在对照组中的表达变化不明显(P>0.05)。在两实验组中的表达均呈下降趋势，但仅12.5 μmol/L组中的表达下调显著(P<0.05)，15 μmol/L组无明显下调(P>0.05，见表1，图4)。

图2 5-Aza-CdR干扰24 h后JEC细胞p57kip2基因启动子区甲基化情况

▲：与对照组比较，P<0.05；★：两实验组之间比较，P<0.05。图3 5-Aza-CdR干扰JEC细胞的OD值

表1 5-Aza-CdR干扰JEC细胞24、72 h后P57kip2蛋白表达

2.5 5-Aza-CdR干扰72 h后JEC细胞的形态变化

2.5.1 倒置显微镜观察JEC细胞的形态变化 对照组JEC细胞主要呈多边形或长梭形，可见明显的围腺腔样结构(见图5)。12.5 μmol/L组较对照组和15 μmol/L组细胞密度略微减少，15 μmol/L组细胞密度较对照组无明显差异，未见明显细胞形态改变。

图4 5-Aza-CdR干扰24、72 h后P57kip2蛋白在JEC细胞中的表达情况

A:对照组;B:12.5 μmol/L组;C:15 μmol/L组。图5 3组JEC细胞72 h后的细胞生长情况

2.5.2 TEM和SEM观察JEC细胞的超微结构变化 对照组：JEC细胞多数呈椭圆形，细胞游离面可见微绒毛；细胞内部可见线粒体、内质网、自噬溶酶体散在分布于胞质内，还可见分泌泡、脂滴，细胞核大，核仁明显，核膜齿状曲折(见图6)。

和对照组比较，5-Aza-CdR干扰72 h后，两浓度组JEC细胞表面的微绒毛更加丰富，分泌泡明显增多；部分细胞内质网扩张明显，个别细胞内自噬现象更明显，未见明显线粒体肿胀(见图7～8)；两浓度组细胞形态改变无明显区别。

图6 对照组JEC细胞72 h后的细胞超微结构

微绒毛(↑)，分泌泡(↑↑,★),自噬现象(↑↑↑)。图7 12.5 μmol/L组JEC细胞72 h后的细胞超微结构

微绒毛(↑)，分泌泡(↑↑,★),自噬现象(↑↑↑)。图8 15 μmol/L组JEC细胞72 h后的细胞超微结构

3 讨论

子宫内膜癌变是一个复杂的过程，肿瘤抑制基因失活、癌基因激活、DNA修复异常等参与其中。DNA启动子高甲基化是子宫内膜癌中肿瘤抑制基因失活的重要机制之一[10]。

p57kip2是最迟被发现的细胞周期依赖性激酶抑制剂，位于染色体11p15.5，包含4个外显子和3个内含子，全长22 kb，其编码的蛋白质分子量为572 kDa，由316个氨基酸构成[11]。p57kip2作为一种候选的肿瘤抑制基因，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等组织中表达明显下调或缺乏，其表达水平较高时预示着肿瘤的分化程度较高、临床分期较早、淋巴结转移率较低、预后较好[12-14]。本研究发现，在JEC细胞中，p57kip2基因外显子组未发生突变，提示p57kip2蛋白在子宫内膜样癌细胞中的异常表达可能与表观遗传修饰中DNA甲基化等有关。

表观遗传学修饰是在不改变DNA碱基序列的前提下，改变基因的表型，进而使基因功能发生可遗传的变化，主要有DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(Histone modification)、染色体重塑(Chromatin remodeling) 和小RNA(MicroRNA) 调控等表现形式[15]。DNA甲基化是一个动态的、可逆转的调节过程，可通过抑制DNMT酶活性、脱甲基、酶促5-mc降解等方式阻止甲基化过程，使DNA在复制循环的过程中逐渐去除DNA甲基化[16-17]。我们研究发现，在未行干预的JEC细胞中，p57kip2基因启动子区呈高甲基化状态。提示在子宫内膜癌组织或细胞中，p57kip2基因启动子区高甲基化状态可能导致p57kip2对细胞增殖的负调控作用被抑制。

5-Aza-CdR又名地西他滨，是目前体内外用于抑制DNA甲基化最常用的药物，能使DNMT失活来抑制甲基化过程，从而使处于高甲基化状态的基因去甲基化、恢复抑癌基因的功能[18]。吴晓玲等[19]发现，宫颈癌组织中SOX11基因(被认为是一种抑癌基因)沉默与其启动子区高甲基化密切相关，经去甲基化药物5-Aza-CdR处理后，SOX11恢复表达。黄丽萍等[8]研究显示，子宫内膜癌HEC-1-B细胞经5-Aza-CdR处理后，RASSF1A基因及其蛋白重新表达，发挥其抑制细胞增殖、侵袭的能力，且5-Aza-CdR对RASSF1A基因去甲基化及其蛋白表达增加的调控具有时间和浓度依赖性。Yang等[9]发现，使用5-Aza-CdR处理人结肠癌HCT116细胞后，能快速抑制细胞生长和延长细胞倍增时间，在没有进一步加药治疗的情况下，细胞生长抑制状态会逐渐逆转，使用HM450 DNA甲基化阵列长期监测DNA甲基化的变化，发现不同位点的再甲基化率不一致。

我们研究发现：JEC细胞经各浓度5-Aza-CdR(5、7.5、10、12.5、15 μmol/L)干扰24 h后，其总体甲基化率(分别为88.1%、83.8%、85.8%、76.2%、83.1%)均低于对照组(88.8%)，其中12.5 μmol/L组(76.2%)、15 μmol/L组(83.1%)的p57kip2基因部分位点去甲基化效果显著，总体甲基化率下降明显。和对照组比较，12.5 μmol/L组总体甲基化水平下降最明显。和对照组比较，两实验组P57kip2蛋白表达均有上调，细胞生长均被抑制，但以12.5 μmol/L组最明显。随着5-Aza-CdR作用时间延长，两实验组P57kip2蛋白表达有所下降、细胞生长水平有所增长，这与Yang等[9]的研究相似、与黄丽萍等[8]的研究不一致，可能与没有持续追加5-Aza-CdR维持去甲基化水平有关，还可能与肿瘤的不同组织类型、不同细胞系对5-Aza-CdR的敏感性及其内在基因组表观特征不同有关；我们还发现，两实验组较对照组细胞密度略有减少、细胞表面微绒毛均更丰富，细胞内分泌泡和自噬现象均增多。由此可以得出，在JEC细胞中，P57kip2处于高甲基化状态，使其负向调控细胞进程的作用被减弱，细胞明显增殖。5-Aza-CdR干预后，可下调JEC细胞中p57kip2基因启动子区甲基化水平，上调P57kip2蛋白表达，激发其负向调控细胞周期的作用，从而抑制JEC细胞增殖，其中12.5 μmol/L组的生长抑制作用比15 μmol/L组更明显，可能还使JEC细胞往更好的分化方向转变；随着时间的延长，没有进一步追加5-Aza-CdR，p57kip2启动子区逐渐恢复甲基化，导致P57kip2蛋白表达上调的趋势再次被减弱，细胞生长的抑制状态也会被逆转。5-Aza-CdR的去甲基化效果可能需要持续加药来维持，将是下一步实验需要验证的问题。