非洲猪瘟的诊断与防控措施

贺 灿 ，张 彬

（1. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南新五丰股份有限公司，湖南 长沙 410005）

非洲猪瘟（African Swine fever ,ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的家猪和野猪的一种高度接触性传染病，临床表现高热、不食、皮肤和内脏广泛性出血，急性死亡率可达到100%，可造成严重的养殖损失。非洲猪瘟病毒在分类上是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟属目前的唯一成员，是一种双链DNA分子病毒，基因组大小170～190 kb，研究已知能编码100种以上的蛋白质。非洲猪瘟病毒在病猪的血液、粪便、口鼻液和病变组织器官中大量存在，环境中存在有机载体的情况下该病毒具有非常强的生存能力，冻肉冷库中甚至可以存活好几年。ASFV感染途径和传播方式众多，最直接的传播方式是健康的猪只身体直接接触发病猪，而正常猪群饲喂受到ASFV污染的饲料和厨余垃圾等，或者通过消化道和呼吸道接触血液、污染的运猪车辆等均能直接或间接感染该病。ASFV的可怕之处还在于防控与治疗的难度非常大，目前世界上尚无上市的有效的非洲猪瘟疫苗产品，因此当前在该病流行国家主要依靠科学的实验室诊断与完善生物安全防控体系来保证养猪生产安全。文章中采用TaqMan 探针实时荧光PCR技术，是一种快速、准确的非洲猪瘟病毒检测方法，结合非洲猪瘟传播感染途径的特点，文章提出制定科学的诊断程序与防控措施来保证养猪业的生产安全。

1 非洲猪瘟诊断技术

1.1 科学诊断方法的建立

目前，非洲猪瘟抗原检测方法主要有红细胞吸附试验（HAD），直接免疫荧光（DIF）试验，聚合酶链式反应（PCR），荧光定量PCR法（RQ-PCR），环介导等温扩增技术等。抗体检测主要是胶体金试纸条法和ELISA抗体检测。实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展扩充的核酸定量技术，分为相对定量和绝对定量，它具有高灵敏度——精确到单拷贝数，极宽的动态范围可达9个数量级的检测范围，高精确度——重复性好，高准确度——是目前公认的定量金标准[1]。其特点是扩增与检测能同步进行，快捷方便，八连管内闭管反应，降低污染风险，检测方法多种多样，应用灵活[2]。因此，猪场非洲猪瘟诊断实验室以荧光定量PCR法为基础来建立。

荧光定量PCR法检测非洲猪瘟病毒，大概可以分成几个步骤。首先是核酸物质的提取：目前常用的3个方法是直接裂解法核酸提取，过滤-裂解法核酸提取，磁珠法核酸提取。然后是PCR的基本原理以及运用：RQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析[1]，在实时荧光定量PCR反应中引入一种荧光化学物质，依照相关的生物学特性，随着PCR扩增反应的进行，PCR反应物不断累积，荧光信号也按等比例不断增加，这样就可以通过实时荧光定量PCR检测平台——PCR仪，随着荧光强度变化监测产物量的变化，从而等到一条荧光扩增曲线图，这样就通过对荧光信号的变化实现对样品中ASFV核酸的快速检测。在选择引入荧光化学物质上最常用到的是TaqMan 探针，它是一种寡核苷酸探针，在PCR扩增反应时，在加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，其结合位点在两条引物之间，且只与模板特异性地结合，荧光报告基团连接在探针的5’末端，而荧光淬灭基团则在3’末端，当完整的探针与目标序列杂交时，荧光基团发射的荧光信号与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基因与淬灭剂分离，从而通过荧光信号的变化实现对目标模板的相对定量检测。

根据对非洲猪瘟病毒基因的认知，在基因位点的选取上，采用TaqMan 探针技术，对ASFV的P72基因保守区设计特异性引物和探针，配以相应试剂进行聚合酶链式反应。主要成分：ASFV-反应液包含引物、探针、Dntp、Mg2+、PCR缓冲液等；酶混合物包含热启动Taq酶、UNG酶；设置阳性对照包含非洲猪瘟病毒P72基因序列；阴性对照为空载的灭菌TE溶液即可；内置参照包含内置参照序列，一般为外源基因序列片段。

其中通过检测内置参照是否正常来监测样本中是否具有PCR抑制物，从而避免假阴性；通过减少样本间的交叉污染、实验室设备的污染、前次PCR扩增产物和引物残余污染可减少假阳性。然后是在实时荧光定量PCR检测平台完成检测，即PCR仪，通过对荧光信号的变化实现对样品中ASFV核酸的快速检测。从而得到每个样品的扩增曲线，实现对样品的非洲猪瘟病毒检测。根据扩增曲线图（见图1），对每个样品每个通道的扩增曲线进行分析解读，首先是否为显著的“S”型扩增曲线，阳性对照的CT值是否在“预期”的位置；阴性对照是否报告CT值。

1.2 建立分子检测实验室

建立分子检测实验室，一要合理分区，按区域划分为试剂储存、样品前处理区，样品处理区，PCR扩增体系配制区，PCR扩增与结果分析区。二要保证区域单向流动且具有独立的通风系统。同时配备专业的检测人员，熟悉PCR检测原理，熟练掌握操作步骤，责任心强，工作认真负责，能及时发现并解决问题，对样品的质量进行把关，对实验数据进行收集整理，总结经验。三是配备专业实验器材。包括PCR检测仪、超净工作台、高速离心机、振荡器、移液枪、PCR级实验耗材。四是建立检测实验室与生产的反馈流程，了解检测/监测的目的-问诊及信息填写-采样方案的制定-采样-检测及结果分析-反馈结果-采取措施后的再次检测及数据对比，发挥实验室诊断对生产的指导作用。

2 非洲猪瘟的防控措施

自2018年8月3日我国通报首例非洲猪瘟疫情以来，国内总体防控形势严峻，已对我国的生猪产业发展造成较大冲击，且由于该病毒没有安全有效的上市疫苗产品，同时传播速度极快、死亡率极高的，因此建立健全养殖场非洲猪瘟防控体系尤为重要。

2.1 目前非洲猪瘟防控难点

2.1.1 环境中病毒流通风险大

大量活猪仔猪跨省跨区域的频繁流动，有造成非洲猪瘟蔓延的较大风险，在一些地区不法商贩将病猪或者携带病毒的猪肉及其猪肉制品违规贩卖入市场进行交易流通，这就变成了非洲猪瘟看不见的传染源。而国际旅游的旅客回国时，携带的肉制品，如果处理方法不科学，没有有效的灭活病毒，这些都是环境中病毒传播风险[3]。

2.1.2 生猪复养防控信心不足

在目前没有非洲猪瘟疫苗的大背景下，生猪复养的难度极大，第一轮的非洲猪瘟疫情带来的对养猪业的破坏力以及严重的经济损失，极大地打击了养殖者的养殖信心。同时随着非洲猪瘟疫情的快速蔓延，养殖户没有放心可靠的猪苗来源；另一方面，中小养殖户发生疫情后空置的栏舍的洗消以及复养的安全性得不到有效保障，根据相关防疫要求的设备设施改建，也是一个大工程，而造成资金、心理压力以及优质猪苗来源难等多重压力，没有科学的评估和有效的复养方案很难开启复养的步伐。

2.1.3 全社会共同防控的责任与体系建设有待健全

养殖行业职能及监管部门应强化落实防控主体责任，加强防控应急处理。首先社会监管措施要落实到位，不能停留在表面。之前养猪场主体责任认识度不高、落实不全的问题要纠正过来，一旦发现可疑病例，应及早上报，检测排除隐患。有部分养殖人员仍然存在侥幸心理，认为过了风头再养就没有问题，但是防疫措施如果不落实，复养成功的概率仍然较低。

2.1.4 猪场防控管理难度大

在严峻的大背景环境污染情况下，外环境病毒传播情况不乐观，若对养猪场的生产生活物资，以及人员流通的管理检测不规范不仔细，病死猪淘汰处理不当，与外界接触极易造成交叉感染。猪场生产人员长时间的封场，得不到很好的休假，人身不自由，这也会导致养殖团队的不稳定，以及人员极大的精神压力，管理难度较大。很多养殖场还没有建立检测体系、预警体系/应急体系，发生疫情后容易造成极大的损失，对养殖场的防控打击很大。

2.2 防控策略

2.2.1 加强流通环节的管理

所有养殖上下游行业都应该主动配合相关部门对市场上的生猪及猪肉制品进行严格的流通管理，加大对运输环节的监管力度，这样才能够从根本上对大环境的疫情程度改善有帮助，从源头来控制ASF疫情的再传播。监管部门要根据《关于在加工流通环节开展非洲猪瘟病毒检测公告》，落实保障人民利益和食品安全，维护生猪产业的健康发展，极大降低生猪及猪肉制品在流通环节被感染非洲猪瘟的风险。

2.2.2 生物安全体系建立

养殖场要不断学习，加强危机意识，完善精准“拔牙”，果断处理感染猪只。加大科普力度，提高生猪养殖人员的生物安全意识，并建立合理合规的操作流程，切实将责任落实到具体单位和个人，对猪只和猪舍周边环境及生产物资进行周期性监测，一旦发现异常情况例如猪只发烧不食黏膜发绀等，就立即要加大核酸检测力度，发现可疑或者确诊非洲猪瘟病例，立即上报当地畜牧兽医管理部门，发生疫情立即将病猪扑杀和销毁，并进行无害化处理，严防疫情扩散[4]。养殖场要加强防控设施的建设，尽可能完善生物安全体系，对于部分关键控制点客观条件不能完善的，要决断地退出养殖，不然后患无穷。

2.2.3 加强饲料生物安全管理

要不断加强饲料和饲养管理。根据农业农村部第64号公告的规定，明确了饲料厂不得再以猪血作为原料进行饲料生产和销售。饲料厂应做好厂区内外生物安全管理，做好人员车辆烘干和消毒工作。对于部分风险较大的原料，应及时做好采样检测，合格后才能使用。做好饲料加工工艺的优化，相应地增加调质时间，增加保质器等手段，延长蒸汽调制和保质时间，杀灭病毒。最后应严厉禁止泔水直接饲喂猪只，以免造成传播非洲猪瘟病毒的风险，保障养殖安全[5]。

2.2.4 其他措施

养殖场需要建立自己的检测实验室、烘干房、各级洗消点，配套专门的中转车辆。制定具体的生物安全防控措施，加强对补栏前猪只的检测与存栏猪只的各类监测，以及各类人员物资进出通道的明确，生活生产物资进入处理办法，淘汰猪处理方案和具体实施措施。不给病毒从外界传入的机会，确保安全生产。

3 小结

非洲猪瘟作为养猪业目前严重的疫病之一，极大地影响了养猪行业的发展，因此，我国相关部门也在不断制定严格的疫情控制方案，深入探究非洲猪瘟的感染风险，制定了多项科学合理的防控措施，用以来提高我国养猪业养殖水平。养猪场也应建立健全生物安全防控措施，做好非洲猪瘟的诊断与防控措施，提高生产成绩。