核酸检测在猪病检测中的常见问题与分析

孙华伟 ，郭 静 ，张敬峰 ，李 彬 ，张小飞 ＊

（1.江苏省农业科学院兽医诊断检测重点实验室，江苏 南京 210014；2.安徽省定远县畜牧兽医局，安徽 滁州 233200）

核酸检测依然是病原学诊断的金标准，其病原学证据是无可替代和不容置疑的。在猪病的核酸检测中，假阴性问题及猪群出现疑似感染却迟迟检测不到病原体的情况普遍存在，具体分析如下：

1 新病毒的确认时间周期长

自武汉暴发新型冠状病毒肺炎以来，病毒这个专业术语迅速普及，可以说如今已成为家喻户晓，妇孺皆知的日常用语了。但在20世纪之前，巴斯德、科赫等人提出的细菌致病学说占据主流，人们只知道传染病皆由细菌或其毒素引起，并不知道“病毒”的存在。一个新病毒的出现，从分离到基因全序列测定、确认需要较长的时间周期，仅仅是发现第一个病毒，就花了41年的时间。部分猪病毒病的发现历程见图1。

较长一段时间以来，江苏省农科院兽医诊断检测中心在接诊的临床病例中发现：猪群出现疑似病毒感染，但经实验室检测，常规的 ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV等病毒核酸的检测结果均为阴性，说明这些猪群可能存在新的未知病毒，只是限于目前的检测水平，尚不能确认是何种病毒。

2 采集的待检样品不合格

根据国家卫健委发布的第七版新冠肺炎诊疗方案，从CoVID-19的样品采集可以看出，样品采集对检测结果的影响很大，不少患者到第3次，甚至是第5次才出现阳性，后经比对发现，样品采集的日期或部位对检测结果存在很大影响。同样的道理，对猪群进行血样采集时，尽量采集发病后7 d内的急性期抗凝血，而不是在猪群发病后2周才进行血样采集。采集内脏组织时，尽量采集肿大的脾脏和肿大的淋巴结。

3 核酸提取效果差

3.1 选择正规厂家的核酸提取试剂盒

江苏省农科院兽医诊断检测中心通过对多家核酸提取试剂盒进行比较发现：不同试剂盒对核酸提取的效果差异显著。在选择不同厂家的试剂盒时，酶的活性、变性液的质量、吸附柱的吸附效果及溶解液的溶解效率对样品核酸物质的提取效果影响很大。因此，在选择核酸提取试剂盒时尽量先用标准物质进行验证，而不能贪图便宜，选择质量没有保证的试剂盒。

3.2 使用核酸浓度分析仪

由于核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰，蛋白质的吸收高峰在280 nm波长处，因此，A260/A280是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，A260 / A280的比值应该介于2.0～2.5。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，说明提取的核酸纯度较低，表示可能有盐离子或者有机试剂污染[1]，需要纯化样品。见图2和图3。

江苏省农科院兽医诊断检测中心在使用不同厂家的试剂盒进行核酸提取后发现：不同厂家试剂盒对同一样品进行核酸提取时，核酸提取效果差异很大，部分厂家的核酸提取试剂盒在对标准物质进行核酸提取后，核酸浓度很低。建议实验室自行对不同的核酸提取试剂盒进行比对分析，筛选出质量稳定、适合本实验室的核酸提取试剂盒。

4 小结

对于疫病诊断，最重要的是以最快速度做出明确诊断，这样才能为后续的治疗以及防控提供重要依据与基础。通过实验室检测，密切监测病原体在猪群中的感染趋势和带毒量，对猪场快速、高效防控起到至关重要的作用。但实验室检测是一个系统工程，绝非招聘几个检测人员、买几台仪器这么简单，因地制宜地制定样品采集方案，操作规范，试剂盒质量可靠，监督环节不缺失等，是输出合格检测结果的重要保障。