小胶质细胞介导的炎症反应在衣霉素所致的小鼠视网膜损伤中的作用△

曹长顺 杜益茗 柯宗文 张洪英 于利 刘华 姜双 车慧欣 骆玮

小胶质细胞是广泛分布于中枢神经系统的一种神经胶质细胞，过度激活时会产生大量炎症因子，这是导致很多视网膜疾病潜在的发病机制[1]。小胶质细胞是体内免疫防御机制的调节剂，在炎症反应过程中发挥重要作用。当小胶质细胞被激活后常引起自身形态学改变并释放炎症因子(IL-6、IL-1、TNF-α等)，如果这些炎症因子长期存在于组织中，会加速细胞凋亡，从而对视网膜及中枢神经系统功能产生影响[2-4]。本研究我们探讨小胶质细胞介导的炎症反应在衣霉素所致的小鼠视网膜损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组选用6～8周龄 C57/BL6J 雄性小鼠50 只(北京维通利华动物实验中心提供)，体质量(23±2)g。自由进食和饮水，室温20～23 ℃、湿度 50%～65% ，12 h/12 h昼夜交替光照环境下饲养。将所有小鼠随机分为5组，分别为对照组，DMSO组，衣霉素低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组10只10眼，均取右眼进行实验。本研究动物处理遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。

1.1.2 实验试剂与仪器衣霉素 (沈阳远信宝成公司)，戊巴比妥钠(美国 Sigma 公司)，羟糖苷滴眼液、散瞳剂托吡卡胺滴眼液和 1 g·L-1荧光素钠(日本参天制药株式会社)，荧光素眼底血管造影剂和小动物 OCT、小动物电生理仪(美国Phoenix公司)，Iba1多克隆抗体、NF-κB-P65多克隆抗体、IL-6多克隆抗体、山羊血清、荧光二抗(美国 Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠实验模型制备小鼠适应性喂养2周，自由进食和饮水，室温20～23 ℃，禁食24 h。DMSO组给予小鼠玻璃体内注射DMSO溶液1 μL；衣霉素低剂量组给予小鼠玻璃体内注射50 mg·L-1衣霉素1 μL；衣霉素中剂量组注射100 mg·L-1衣霉素1 μL；衣霉素高剂量组注射150 mg·L-1衣霉素1 μL；对照组给予相同条件下喂养。

1.2.2 OCT检查应用1 g·L-1戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉，滴复方托吡卡胺散大瞳孔，滴甲基纤维素保护角膜，选用小动物 OCT仪进行小鼠视网膜OCT扫描。

1.2.3 HE染色各组小鼠脱颈处死后取眼球，用4 g·L-1多聚甲醛固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，由视神经至角膜中心点进行前后轴向定位，平行于视轴连续切片，厚度约5 μm，将切片常规二甲苯梯度酒精脱蜡至水，进行HE染色，再进行脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.4 闪光视网膜电图检测造模后第7天将小鼠放置于密闭箱里充分暗适应24 h，放置红色背景光，整个实验过程中要注意对小鼠避光，采用1 g·L-1戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉后，滴复方托吡卡胺散大瞳孔，涂甲基纤维素保护角膜，将参考电极插入小鼠尾部皮下，作用电极插入小鼠头部皮下，接地电极连接仪器，将光源滤光片切换到红光后，打开小鼠discover模块，将成像系统镜头接触角膜，投射光线投入眼底，调节焦距到清晰可见视网膜，调整镜头位置和角度将视盘放置视野中央，关闭discover，再将刺激光源切换至白光，打开视网膜电图模块进行测试，刺激视网膜获取视网膜电图。

1.2.5 免疫荧光染色观察视网膜中Iba1和IL-6表达将石蜡切片烤片1 h，进行常规二甲苯梯度酒精脱蜡至水，使用PBST水洗3次，每次5 min，组织切片滴加3 g·L-1H2O2，室温下处理20 min，以充分灭活内源性过氧化物酶，用PBST水洗3次，每次5 min，将切片放置在98 ℃的0.01 mol·L-1枸橼酸缓冲液中10 min进行抗原修复，冷却后用PBST水洗3次，每次5 min，用10 g·L-1山羊血清室温下封闭1 h，滴加一抗4 ℃湿盒处理过夜。第2天，先将切片恢复至室温，之后PBST水洗3次，每次5 min，滴加二抗室温下孵育30 min，PBST水洗3次，每次5 min，滴加DAPI(1500，1 min)对细胞核进行染色，PBST水洗3次，每次5 min，用缓冲甘油封片。

1.2.6 Western blot检测各组小鼠视网膜中Iba1和IL-6表达向分离的视网膜组织中加入RIPA裂解液和适量蛋白酶抑制剂PMSF，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。在SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶上电泳分离总蛋白，并将其转印至PVDF膜，将PVDF膜放入牛血清白蛋白中，室温下封闭2 h后，再放入一抗(Iba1及IL-6)，在4 ℃下孵育过夜。第2天用TBST洗涤，加入二抗室温下孵育30 min，使用底物化学发光ECL法显影。采用β-actin作为内参照物。

1.3 统计学方法本研究所得数据以均数±标准差表示，用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，多组比较采用方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠视网膜OCT检查及眼球组织HE染色结果对照组及DMSO组小鼠视网膜各层细胞排列整齐，结构清晰，形态规则，并未出现明显的结构变化；衣霉素低剂量组视网膜各层结构紊乱，视网膜外层呈波浪状改变，并出现细胞核排列紊乱；衣霉素中剂量组及高剂量组视网膜各层结构紊乱更加明显，并出现神经上皮与色素上皮的浅层脱离，IS/OS层及外丛状层消失(见图1)。

图1 各组小鼠视网膜OCT检查及眼球组织HE染色(×400)结果

2.2 各组小鼠闪光视网膜电图检测结果造模后第7天 ，闪光视网膜电图检测结果显示:对照组与DMSO组a波及b波振幅无差异；与对照组相比，衣霉素低剂量组、中剂量组及高剂量组a波、b波振幅下降，且呈剂量依赖性，其中a波振幅下降更为明显，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见图2)。

2.3 各组小鼠视网膜组织中Iba1及IL-6表达情况Iba1是小胶质细胞的一种特异性染色抗体，免疫荧光染色及Western blot检测结果显示：对照组及DMSO组视网膜中Iba1表达量较少，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，且大部分阳性表达位于视网膜神经节细胞层及外丛状层中，细胞核中几乎无表达，且小胶质细胞形态较为规则；衣霉素低剂量组、中剂量组及高剂量组视网膜内核层及外核层中Iba1表达量明显增多，且呈剂量依赖性，各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)；此外，随着衣霉素浓度的增高，呈现由视网膜内层向外层侵袭的趋势。视网膜中IL-6呈现与Iba1相似的表达(见图3和图4)。

图2 造模后第7天各组小鼠闪光视网膜电图检测结果

图3 免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜组织中Iba1及IL-6表达结果(×400) 蓝色示DAPI，绿色示Iba1或IL-6

图4 Western blot检测各组小鼠视网膜组织Iba1、IL-6表达情况 NS示组间比较P>0.05，#示组间比较P<0.05，*示组间比较P<0.01,**示组间比较P<0.001

3 讨论

小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，相当于中枢神经系统中的巨噬细胞。 正常状态下，小胶质细胞处于非激活状态，可分泌神经保护因子和抗炎因子，一旦受到感染刺激或者组织受损，内源性的刺激因子将激活小胶质细胞，引起细胞增殖，形态改变，吞噬功能增强，迁移至损伤部位，并分泌各种细胞因子[5-6]。小胶质细胞激活后迅速迁移至病变部位，所产生的各种炎症因子如果在组织中长期存在，会导致视网膜细胞加速凋亡，严重影响视功能。视网膜起源于神经外胚层，是中枢神经系统的一部分[7]。它位于眼球壁的内层，最外层的视网膜色素上皮细胞、神经元细胞(包括光感受器细胞、双极细胞、神经节细胞)、神经胶质细胞(包括小胶质细胞和大胶质细胞)是组成视网膜的重要细胞,双极细胞和神经节细胞通过外丛状层和内丛状层的突触相互连接[8]。当光感受器细胞能感受光刺激，将光信号转换为电信号，经双极细胞传递至神经节细胞，而小胶质细胞在神经元之间的电信号传递中发挥着重要作用，如果没有小胶质细胞，虽然视网膜结构无明显改变，但其电信号传递会受到严重影响[9]。

衣霉素是实验中常用的一种内质网应激激活剂，它可以抑制糖基化反应引起内质网应激，内质网应激产生大量未折叠蛋白长期存在于视网膜中会激发视网膜中的炎症反应，这是引起许多视网膜疾病(糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性、视网膜色素变性等)的重要因素[10-12]。此外，小胶质细胞激活后产生的慢性炎症反应也被认为是视网膜疾病发生的潜在原因[1]。本实验通过玻璃体内注射不同浓度的衣霉素，通过OCT及HE染色检测注药后视网膜结构变化，结果显示衣霉素低剂量组小鼠视网膜各层结构紊乱,视网膜外层呈波浪状改变，细胞核排列紊乱，衣霉素中剂量组、高剂量组神经上皮与色素上皮出现浅层脱离，视网膜各层结构紊乱更加明显，IS/OS层及外丛状层消失，这证明衣霉素对视网膜色素上皮层、感光细胞层及双极细胞层均有损伤。

为进一步证明衣霉素对视网膜功能的影响，对小鼠进行闪光视网膜电图检测，结果发现与对照组相比，衣霉素低剂量组、中剂量组及高剂量组a波、b波振幅下降，呈剂量依赖性，其中a波下降更为明显。可见衣霉素所致小鼠视网膜损伤涉及视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞及双极细胞等，并且其对视网膜外层的损伤相比于内层更为严重，而DMSO溶液作为衣霉素的有机溶剂，对视网膜结构及功能几乎无损伤作用。

免疫荧光染色及视网膜Western blot检测小胶质细胞的特异性染色蛋白Iba1结果显示，对照组及DMSO组Iba1表达量较少，且大部分阳性表达于视网膜神经节细胞层及外丛状层中，细胞核中几乎无表达，小胶质细胞形态较为规则；衣霉素低剂量组、中剂量组及高剂量组视网膜内核层及外核层中Iba1表达量明显增多，且呈剂量依赖性；此外，随着衣霉素浓度的增高，呈现由视网膜内层向外层侵袭的趋势。IL-6在视网膜中呈现与Iba1相似的表达趋势。这说明衣霉素眼内注射后会引起小胶质细胞大量激活。然而，由于视网膜结构复杂，其结构和功能的损伤机制仍然未知。Rana 等[13]通过消融内质网应激相关蛋白Chop后，注射衣霉素发现组织中相关炎症因子减少，这说明这种炎症反应与内质网应激有关。小胶质细胞所介导的炎症反应是一个极为复杂的过程，通过降解IkB，使得NF-κB异位到细胞核，进而引起相关炎症反应[14]。

综上，小胶质细胞参与衣霉素所致的小鼠视网膜损伤过程，并产生相关炎症因子引起视网膜功能及结构改变。