基于光诱导电聚合的IgG/PEGDA 复合水凝胶微结构的图形化加工方法

孙雨阳， 罗 均， 刘 娜， 杨 扬， 孙 翊

(上海大学机电工程与自动化学院， 上海200444)

蛋白质药物在体内环境中可能因受到多种复杂的化学降解和物理反应而失活， 如凝聚、沉淀、水解等. 同时， 蛋白质药物具有半衰期短， 清除率高， 分子量大， 透膜能力差， 易受到体内酶、细菌以及体液破坏的特点[1]. 水凝胶具备优良的生物相容性和生物组织相似性， 在药物储存、运输方面有着广泛应用[2]. 如含水量较高的水凝胶可以为有机小分子提供含水环境， 保留蛋白质药物的生物活性， 使得水凝胶封装的蛋白质比分散在溶液中的自由蛋白质更具耐变性[3]. 将蛋白质药物包封在水凝胶中， 可以对蛋白质起到一定的保护作用[4]， 并可用于蛋白质药物的可控释放.

聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate， PEGDA)水凝胶具有较好的化学、机械和生物特性， 可有效屏蔽封装药物的生物免疫原性， 增强其对外界条件(酸、碱、酶、水和热等)的耐受能力， 延长生物药物在动物体内的半衰期， 是用于药物可控释放和组织工程研究的理想载体材料之一[5]. 实现蛋白质封装并形成特定水凝胶微结构的加工方法对上述应用有直接影响， 具有重要研究价值[6]. 目前， 用于PEGDA 水凝胶微结构的加工方法， 如激光扫描光刻法[7-9]、投影印刷技术[10-12]等， 主要是基于紫外光诱发光敏引发剂的聚合原理. 在这些方法中， 水凝胶的形状主要通过设计光学掩膜板或设置紫外激光扫描路径来控制[13]. 然而， 紫外线照射和光引发剂具有生物毒性， 容易引发蛋白质的改性， 并且基于紫外固化的加工难以实现管状和高深宽比等复杂微结构的加工[14]. 电化学聚合原理也可用于PEGDA 水凝胶的固化成形， 但是传统电聚合方法加工的水凝胶结构厚度有限(几百纳米)， 且不能灵活控制水凝胶的几何形状[15].

针对蛋白质封装复合水凝胶的应用需求， 以及当前PEGDA 水凝胶加工方法的不足， 本工作研究了一种基于光诱导电聚合原理的水凝胶图形化加工方法， 并以免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)为例，通过实验分别实现了PEGDA 水凝胶微结构和IgG/PEGDA复合水凝胶微结构的图形化加工. 本方法不需要采用定制的光刻掩膜板、紫外光和光敏引发剂， 而是利用电脑设计的光斑图形通过聚光镜投射到光诱导芯片上实现图形化加工. 在加工过程中， 投射到光诱导芯片上的光图形通过光电转换原理在光诱导芯片上产生图形化的虚拟电极. 该虚拟电极在交流电压的作用下可诱导PEGDA分子在其表面发生聚合反应并封装蛋白质分子形成复合凝胶微结构. 由于聚合反应只在虚拟电极表面发生， 因此水凝胶微结构的形状与光斑图形一致， 通过改变光斑图形来改变虚拟电极的形状即可改变凝胶微结构的形状. 此外，在凝胶微结构加工过程中， 凝胶微结构的高度随着聚合时间的增加而增加， 可以通过控制聚合时间来实现对凝胶微结构高度的控制. 因此， 通过调控光斑图形和聚合时间， 即可实现多种几何形状的水凝胶微结构加工.

1 实验方法和材料

1.1 实验系统

图1 为用于水凝胶微结构加工的光诱导电聚合实验系统， 主要有3 个组成部分， 包括图像投影模块、观测控制模块和光诱导电聚合(optically-induced electropolymerization， OEP)芯片[16]. 图像投影模块的投影仪与装有绘图软件(如微软PowerPoint 或Adobe Flash)的计算机(电脑2)相连， 用于设计和输出光斑图形. 投影仪投出的光图形通过聚光透镜被投影到OEP芯片上(见图1 中的插图). OEP 芯片固定在三维移动平台上， 主要包括上层氧化铟锡(indium tin oxide， ITO)玻璃电极、微流体小腔室、下层氢化非晶硅玻璃电极. 氢化非晶硅玻璃电极是利用等离子体增强化学气相沉积(plasma enhanced chemical vapor deposition， PECVD)法将a-Si:H 层加工到ITO 玻璃电极上得到的[17]. 微流体小腔室是利用厚度为50 μm 的双面胶粘合上层ITO 玻璃和下层氢化非晶硅玻璃制成的， 用于容纳PEGDA 分子和蛋白质的混合溶液.观测控制模块由电脑1、显微镜和三维移动平台构成， 用于控制微结构加工位置和实时监测、记录水凝胶的成形过程.

图1 光诱导电聚合实验系统Fig.1 Experimental system for OEP

1.2 溶液配制

用于制作纯PEGDA 微结构的溶液配制过程如下: 将PEGDA 原溶液(分子量为575 或10 kD)与去离子水以 1∶4 混合， 搅拌约 10 min， 直到 PEGDA 充分溶解. 制备的 PEGDA 溶液的分子浓度约为340 mol/m3， 电导率约为1.5×10-3S/m. 用于制备包裹蛋白质的PEGDA 水凝胶微结构的溶液制备过程如下: 在1 mL 质量分数为20%的PEGDA 溶液中添加10 μL 浓度为0.1 g/mL的IgG， 并利用移液枪充分吹匀.

1.3 PEGDA 分子聚合过程

当有光斑图形投射到OEP 芯片上时， 光图形照射区域的a-S:H 会产生电子跃迁形成电子空穴对， 大大增加图形区域的电导率. 在本实验系统中， 将 RGB 值为(0， 255， 0)的绿色光图形通过投影仪投射到氢化非晶硅薄膜上， 使其电导率从10-11S/m 升至10-5～10-4S/m， 形成“虚拟”电极.

当制备水凝胶微结构时， 信号发生器输出的交变电压被加载到顶层和底层的ITO 基板之间， 用于激发水凝胶的电聚合过程. 水凝胶的电聚合主要受电极电位的控制， 当电极/溶液界面上的电势足够大时， 可以激活聚合反应的发生. 当有光图像投射到a-Si:H 芯片上形成虚拟电极时， 虚拟电极处的电极电位远大于无光照a-Si:H 区域的电极电位. 通过控制交流电压的频率和幅值， 可以使PEGDA 分子只在虚拟电极表面进行交联， 形成与投影图像形状相同的水凝胶结构. 图2 是基于COMSOL 仿真软件分析的电压分布， 仿真采用的交流信号为幅值20 VPP， 频率1 kHz 的正弦电压. 可见， 光斑图形照射的a-Si:H 区域的电极电势远大于无光照区域的电极电势.

图2 OEP 芯片电势分布的COMSOL 仿真分析结果Fig.2 Voltage distribution in OEP chip simulated by COMSOL

基于光诱导电聚合的PEGDA 水凝胶固化过程可以由图3 描述[18]. 首先， 溶液中的水合氢离子H3O+运动到氢化非晶硅与溶液的界面层(Step a1)， H3O+分子在界面电场的作用下去水化形成H+(Step a2)并进一步向界面双电层移动， 在界面电势的作用下， H+得到电子被还原成活化氢原子(Step a3). 另一方面， 由于扩散作用， 在固液界面层也会存在大量的PEGDA 分子， 而活化的氢原子可以打开PEGDA 分子中的碳碳双键(C=C)， 进而激发PEGDA 分子发生交联反应(Step b2， 见图3(b))， 交联固化后的PEGDA 结构可以从基底脱附(Step b3)， 使新的聚合反应继续发生， 形成新的PEGDA 结构， 这样一层一层的聚合使得PEGDA 的三维结构制造得以实现. 当电极电势过大或PEGDA 分子浓度过低， 使得产生的活化氢原子来不及被PEGDA 分子消耗时， 多余的氢原子会复合产生氢气分子. 此时， 在PEGDA 三维结构制造过程中会有气泡产生， 由于产生的气泡会在一定程度破坏PEGDA 结构， 因此应该尽量避免[18].

图3 PEGDA 分子的光诱导电聚合反应过程Fig.3 OEP process of PEGDA molecules

2 实验与讨论

2.1 PEGDA 水凝胶微管的制作

为了验证本方法的可行性， 首先实验加工了微圆柱的实心水凝胶微结构. 利用计算机设计4×3， 直径为 13.5 μm 的圆形阵列图像， 如图 4(a)所示. 将图形投影到 OEP 芯片上， 施加电压峰峰值为20 V， 频率为3～5 kHz 的正弦交流电压. 如图4(b)～(f)所示， 在圆形光斑所照区域，PEGDA 分子交联固化形成水凝胶微结构; 随着交联时间的增加， 水凝胶微柱的长度明显增加.但是， 由于重力的作用以及水凝胶微结构自身刚度原因， PEGDA 水凝胶微管不能笔直伸展.

图4 水凝胶微柱阵列的加工过程Fig.4 Manufacturing process of micro-pillar hydrogels arrays

2.2 IgG/PEGDA 复合水凝胶结构

将IgG/PEGDA 混合溶液通入芯片， 用于加工复合水凝胶微结构. 为了验证光诱导电聚合方法能够加工传统加工方法难以加工的圆柱结构， 本实验利用计算机设计了一组4×4， 外径为 54 μm， 内径为 27 μm 的圆环阵列， 用于复合水凝胶微结构加工， 如图 5(a)所示. 加工过程同样采用电压峰峰值为20 V， 频率为3～5 kHz 的正弦交流电压， 并用观测控制模块对水凝胶微结构加工过程进行监测和记录. 图5(b)～(f)分别为交联聚合发生10， 30， 50， 70 及90 s 后的水凝胶结构， 可以观察到随着交联时间的增加， 微结构的高度也在增加， 并且可以观察到水凝胶的结构确实与投射光图像的形状一致， 为空心圆管结构.

为了证明IgG 确实被封装在PEGDA 水凝胶中， 构成了IgG/PEGDA 复合水凝胶， 在水凝胶微结构制作完成后， 先后用酒精与去离子水清洗制作的微结构， 并放置在荧光显微镜下观察. 如图6 所示， 水凝胶微管发出绿色荧光， 表明IgG 确实被封装在PEGDA 水凝胶网络结构中， 形成复合水凝胶. 图6 内部小图为复合水凝胶微管的扫描电子显微镜(scanning electron microscope， SEM)图， 可见粗糙的管状结构.

图5 水凝胶微管阵列的加工过程Fig.5 Manufacturing process of micro-tubular hydrogels arrays

图6 IgG/PEGDA 复合水凝胶微管结构的荧光图及SEM 图Fig.6 Fluorescence and SEM image of IgG/PEGDA hydrogel microtubules

为了测试OEP 方法加工复合水凝胶微结构的最小尺寸， 实验绘制了3 种不同直径(16.2，13.5， 5.4 μm)的圆形图像， 分别用于加工复合水凝胶微结构. 实验采用同一芯片， 聚合时间均为1 min. 实验加工的凝胶微结构用酒精和去离子水进行清洗后， 放置在荧光显微镜下观察.图7(a)～(c)分别为3 种水凝胶微结构的光学图像， 由于去离子水的冲洗作用使得加工的凝胶微结构失去了原有的阵列排布. 图7(d)～(f)分别为3 种水凝胶微结构的荧光图， 结果显示IgG分子被充分地封装在了交联的水凝胶微结构中. 图7(g)～(i)为3 种水凝胶微结构的SEM 图，3 种结构的直径分别为 14～16， 11～12， 3～4 μm， 可见加工图形的直径略小于施加的光斑图形的直径. 比较图7(g)～(i)可以看出， 利用不同尺寸的光斑图像， 在相同的聚合时间内凝胶微结构的高度不同， 其中光斑直径较小时凝胶微结构的长度更长. 这是因为当光斑直径较小时， 单位时间参与交联固化的PEGDA 分子较少， 短时间从溶液扩散到电极表面的PEGDA 分子就足以满足聚合反应， 凝胶结构生长速度较快; 而随着光斑直径的增加， 单位时间参与交联固化的PEGDA 分子增多， 所需要的PEGDA 分子扩散时间也会增加， 凝胶结构的生长速度变慢.总体而言， 凝胶微结构的高度随着交联时间的增加而增加， 但其增加速度受到电极表面电势和PEGDA 分子浓度的影响. 由于聚光镜和投影仪配置的局限， 本实验系统可设计的最小有效光斑尺寸为5.4 μm， 所以加工凝胶微结构的最小尺寸为3～4 μm.

图7 3 种不同尺寸凝胶微结构的光学图像、荧光图像和SEM 图Fig.7 Optical images， fluorescence images and SEM images of 3 different sizes of hydrogel microstructures

3 结束语

本工作提出了一种基于光诱导电聚合原理的IgG/PEGDA 复合水凝胶加工方法. 利用COMSOL 仿真软件对光诱导电聚合过程的电压分布进行了仿真研究. 同时， 通过实验实现了IgG/PEGDA 复合水凝胶的微管和微柱结构加工. 与传统的PEGDA 水凝胶加工方法相比， 本方法不需要紫外光、光引发剂以及物理光刻掩膜， 而是直接利用光诱导电聚合原理， 通过控制光斑图形和聚合时间实现多种形状的水凝胶微结构加工. 尽管只实验验证了封装IgG 的复合水凝胶加工过程， 但本方法同样适用于其他可电聚合的水凝胶分子和蛋白质封装.