贝伐单抗联合化疗对中晚期非小细胞肺癌患者外周血T淋巴细胞及调节性T 细胞的影响

金珊珊，张锦英

（南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏 南京）

0 引言

肺癌是现今最常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率和死亡率都占据首位且仍在上升[1]。目前，中晚期非小细胞肺癌主要的临床治疗措施依旧是以化疗为主，培美曲塞联合铂类一直是非小细胞肺癌化疗的主要药物[2]。除此之外，化疗联合分子靶向药物的治疗也是近些年来恶性肿瘤治疗的一个研究热点。其中，罗氏公司研发的贝伐单抗是较早进入临床应用的一个分子靶向药物。贝伐单抗能够特异性的与血管内皮生长因子(VEGF）结合，使其与受体的相互作用受阻，从而抑制血管的内皮细胞增殖，减少肿瘤新生血管的生成，达到抑制肿瘤生长的目的[3,4]。

目前，联合贝伐单抗的化疗方案正越来越多的应用于临床。多项研究证实，与单纯化疗相比，贝伐单抗联合化疗药物使用具有明显的协同作用，可以显著提高患者的治疗有效率及生存期[5]。国内外文献对于贝伐单抗联合化疗治疗非小细胞肺癌效果的相关疗效已经有大量报道，但对于其对肺癌患者体内免疫状况的研究却不多见。T 淋巴细胞亚群正是反应人体内免疫功能的主要指标，可随着患者病情的改变而发生变化；调节性T 细胞是目前已知的人体内功能最为强大的免疫抑制细胞之一，具有负性调控的作用，能够促进肿瘤的发生和生长[6-8]。根据目前对肿瘤免疫的研究表明，在肿瘤患者体内往往存在着效应T 细胞被抑制及Treg 细胞高表达的紊乱状态[9]。因此，本研究对贝伐单抗联合化疗治疗的中晚期非小细胞肺癌患者外周血中的T 淋巴细胞及调节性T 细胞的表达比例进行检测，分析其中的关联，探讨贝伐单抗对他们表达水平的影响及其与非小细胞肺癌疗效和预后的关系，为以含贝伐单抗的治疗方案对肺腺癌患者的临床疗效评价和预后提供帮助。

1 对象与方法

1.1 病例选择与一般资料

选择2014年1月至2020年1月南京医科大学第一附属医院肿瘤科就诊的中晚期非小细胞肺癌患者50 例，按照治疗方式的不同将所有患者分为对照组和观察组。对照组25 例，男性13 例，女性12 例；年龄29～75 岁，平均年龄（57.8±12.8）岁，均接受培美曲塞加铂类化疗(500mg/m2d1+75mg/m2）。观察组25 例，男性15 例，女性10 例；年龄30～76 岁，平均年龄（57.3±9.3）岁，均接受贝伐单抗联合培美曲塞加铂类治疗，贝伐单抗的用量为7.5mg/kg。比较两组患者的一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05）。全部的病例均经细胞学或组织病理学确诊为非小细胞肺癌，预计生存期不低于3 个月，患者均经影像学证实，有可客观评价的靶病灶。

1.2 检测方法

所有肺癌患者用EDTA-二钾抗凝真空采血管在治疗前三天内及治疗4 周期结束分别抽取外周血2 mL，采用BD 公司的CD4/CD8/CD3 FITC/PE/PC5/ 三色标记的抗体，CD3/CD16+56 FITC/PE 双 标 记 的 抗 体 及 CD4/FITC、CD127/PE、CD25/PC5 标记的抗体， 利用FC500 流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群及Treg 细胞。

1.3 观察指标

每位患者每治疗2 个周期进行1 次影像学检查以评价疗效，至少完成4 个周期的治疗。检测患者治疗前三天内及治疗4 周期结束后外周血中T 淋巴细胞亚群、Treg 细胞的比例，分析其与患者临床特征的关系。

临床疗效按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)[10]进行，分为CR(完全缓解):所有病灶消失；PR(部分缓解):治疗开始后记录到的最小靶病灶长径总和缩小≤30%；SD (疾病稳定):基线病灶长径总和有缩小但未达PR 或有增加但未达PD；PD (病情进展):基线病灶长径总和增加≥20% 或出现新病灶。以CR+PR 例数占每组患者总数的百分率为客观有效率(ORR)，以CR+PR+SD 例数占每组患者总数的百分率为疾病控制率(DCR)。

1.4 统计学方法

实验结果均采用SPSS 19.0 软件进行统计分析和处理，所有数据以均数±标准差（±s）表示，计数资料采用配对t检验进行治疗前后组内分析，独立样本t检验进行组间分析，相关性分析采用 Pearson 相关性分析,以P＜0.05 时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体疗效

两组患者均完成4 个治疗周期, 可以评价其临床疗效。根据疗效评价，观察组无CR，PR1 例，SD23 例，PD1 例，客观有效率ORR 为4%,疾病控制率DCR 为96%；对照组无CR，PR1 例，SD17 例，PD7 例，客观有效率ORR 为4%,疾病控制率DCR 为72%。见表1。

表1 两组患者总体疗效分析

2.2 两组患者治疗前后免疫功能的分析

治疗前，比较两组CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、Treg 细胞，差异均无统计学意义(P=0.79,P=0.29,P=0.13，P=0.6);治疗后，两组CD3+T 细胞、CD4+T 细胞均明显高于同组治疗前，Treg 细胞明显低于同组治疗前(P均＜0.05),两组CD8+T 细胞较之前有所下降，但是下降并不明显，差异无统计学意义（P=0.18,P=0.14）；贝伐单抗观察组CD3+T 细胞、CD4+T 细胞相比对照组均显著提高， Treg 细胞相比对照组明显降低，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 两组患者治疗前后免疫功能的分析

2.3 两组患者治疗前后外周血 CD3+T 细胞 与 Treg 细胞表达的相关性分析

对50 例肺癌患者治疗前后外周血中CD3+T 细胞与Treg细胞的比例进行相关性分析，发现二者之间均呈负相关关系(r=-0.36, r=-0.58,P均＜0.05)。见图1，2。

图1 治疗前外周血CD3+T 细胞与Treg 的相关性分析

2.4 不良反应

贝伐单抗联合培美曲塞加铂类治疗患者均无因发生严重不良反应而停止治疗的病例。患者在治疗过程中的不良反应较轻，均能很好耐受。主要的不良反应为高血压和蛋白尿，伴随着一些轻度的恶心呕吐、腹泻、中性粒细胞下降、血小板减少和肝损害等，这些不良反应往往较轻微，经过相应的对症处理后均能有效缓解，不影响患者的继续治疗。

图2 治疗后外周血CD3+T 细胞与Treg 的相关性分析

3 讨论

肺癌目前的发病率呈显著增长的趋势，中国大部分的中晚期肺腺癌患者在确诊时已经无法进行手术切除，因此目前治疗中晚期非小细胞肺癌的主要临床措施还是以化疗为主的内科综合治疗。培美曲塞联合铂类的化疗方案虽然被证明对中晚期非小细胞肺癌有效且相对安全，但近年来总体生存率未见明显改善[11]。因此，临床上需要一类药物，可以显著提升中晚期肺癌的疗效，以及提高患者的生活质量并延缓其生命。目前的研究表明，在肿瘤的发生、发展中，VEGF 参与了肿瘤组织微血管的形成，中晚期非小细胞肺癌的发生机制也可能与VEGF 及其受体有关[12]。因此，抑制VEGF 的表达，有利于抑制肿瘤的生成和发展[13]。贝伐单抗是世界上第一个抗肿瘤血管生成的分子靶向药物，对肿瘤新生血管具有明显的抑制作用，能够促进肿瘤组织的萎缩凋亡。此外贝伐单抗能够改善肿瘤血管的通透性，进而改善肿瘤微环境，促进化疗药物更有效的作用于瘤体，抑制肿瘤的发展[14]。

随着对肿瘤免疫的不断深入研究，我们发现肺癌患者的免疫状态均存在不同程度的改变，常规的放化疗亦会加重机体的负担使其免疫功能低下[15]，而肿瘤的发生发展同时又与患者的免疫状态密切相关。在机体抗肿瘤免疫中主要以T 淋巴细胞较为关键，T 淋巴细胞亚群也是反映机体免疫功能状态的重要指标之一，T 淋巴细胞的减少可以引起机体抗肿瘤免疫功能降低[16,17]。另外，Treg 这类具有负向调控作用的细胞在导致肺癌患者免疫功能紊乱中也扮演着重要角色，它的含量与肺癌的生成与发展、治疗与预后也明显相关[18]。研究表明，Treg 细胞是目前已知的人体内功能最为强大的免疫抑制细胞之一，可以分泌多种具有抑制性的细胞因子，如IL- 4、IL-10 和TGF-β，从而抑制效应T 细胞的活化；可以通过干扰免疫细胞的正常代谢来抑制机体的免疫功能[19,20]。随着研究的深入，显示出Treg 细胞不仅能够抑制CD3+T 细胞和CD4+T细胞，还能够抑制NK 细胞。在肿瘤患者的外周血中，Treg 细胞的表达比例显著升高，数量明显增多，且通常与患者预后呈负相关性[21-23]。因此检测T 淋巴细胞亚群及Treg 细胞的表达比例能够反映肺癌患者免疫状态及治疗效果[24,25]。

本研究以中晚期非小细胞肺癌患者为研究对象，探讨贝伐单抗联合化疗治疗肺癌患者的临床效果及对T 淋巴细胞亚群和Treg 细胞的影响，以期为中晚期肺癌的治疗和预后探讨更优途径。在本研究中，观察组的客观有效率和疾病控制率分别为4%和96%，显著高于对照组的4%和72%，说明培美曲塞联合铂类化疗的方案虽然对肺癌患者有一定的效果，但是贝伐单抗联合化疗的疗效明显优于单纯化疗，这与之前的一些研究报道基本一致[26]。两组患者在接受4 个周期的治疗后，外周血中CD3+、CD4+T 细胞的比例均较治疗前有明显的提升，CD8+T 细胞和Treg 细胞的比例也比治疗前显著下降，说明治疗前肺癌患者的免疫功能处于被抑制的状态。在接受了治疗后，患者的免疫功能有所好转，肿瘤的生长也被抑制。在治疗后，观察组患者的CD3+、CD4+T 细胞比对照组也有明显的提高，Treg 细胞明显降低，说明虽然两种治疗方法均能提升患者的免疫能力，延缓肿瘤的发展，但是贝伐单抗联合化疗比单纯的化疗对于患者免疫功能的恢复和提高更加明显，对肿瘤的抑制效果也更加明显。结合两组患者治疗效果，提示外周血中 T 淋巴细胞和Treg 细胞的水平可随着患者病情的改变而发生变化，通过检测其水平能够有效预测患者的疗效和预后情况。在本研究中，同时将两组患者在治疗前后的CD3+T 细胞和Treg 细胞进行了相关性分析。显示在治疗前后，CD3+T 细胞和Treg 细胞二者的比例均呈现负相关的关系。既往有研究指出T 淋巴细胞水平和肿瘤进展有着密切联系。T 淋巴细胞不仅能够直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过激活免疫系统的其他成分来发挥抗肿瘤效应。机体正常状态下Treg 细胞的表达比例较低，恶性肿瘤细胞能够激活Treg 细胞，促使他们通过不同的机制激活和扩增，成为具有免疫抑制功能的细胞，进而抑制免疫系统，并促进肿瘤的发展[27]。肺癌患者在接受治疗前外周血中Treg 细胞的表达比例明显升高并抑制CD3+T 细胞的表达，在接受治疗后，随着Treg 细胞比例的下降，CD3+T 细胞呈显著的上升趋势，且接受贝伐单抗联合治疗的患者外周血中Treg 细胞的降低幅度及CD3+T 细胞的上升幅度均远高于单纯化疗组的患者。显示出贝伐单抗具有强大的免疫调节能力，能够抑制肺癌患者体内的Treg 细胞，有效调节机体的免疫应答，提高T 淋巴细胞的水平，最终改善肿瘤患者的免疫功能。同时，本研究也证实了外周血中Treg细胞的比例与患者的疗效和预后呈负相关性，有效抑制肺癌患者体内Treg 细胞的表达量将有助于提高肺癌的治疗效果。

综上所述，T 淋巴细胞及Treg 细胞的状态可以反映机体的抗肿瘤免疫水平，检测外周血中T 淋巴细胞及Treg 细胞的表达水平有助于评估疗效，判断预后。结合本次的研究结果，可以推测出贝伐单抗联合化疗可以提升中晚期非小细胞肺癌患者的免疫功能，增强肺癌的治疗效果，其治疗效果一定程度上可以通过监测T 淋巴细胞及Treg 细胞的表达来实现。但本研究的样本量较小，后期可能需要更多样本进一步证实贝伐单抗在临床用药中的优势。