烟蒜轮作对烟株根际土壤细菌群落结构的影响

徐新雯，林正全，拓阳阳*，陈玉蓝，李 斌，丁亚茹，李红丽，王 岩，孙志平

(1.四川省烟草公司凉山州公司德昌分公司，四川 德昌 615500；2.四川省烟草公司凉山州公司宁南分公司，四川 宁南 615400；3.四川省烟草公司凉山州公司，四川 西昌 615000；4.郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450001)

【研究意义】土壤是作物生长养分的主要来源，健康土壤是生产优质作物的重要条件之一。土壤健康与否是土壤的物理、化学和生物学性质以及形成这些性质重要过程的综合体现[1]，健康的土壤具有较高的生物多样性和较高水平的内部养分循环。土壤微生物参与生态系统的物质循环和能量流动、有机物分解、腐殖质形成、养分转化等生化过程，其丰度和多样性对土壤生态系统稳定具有重要作用，其变化与土壤结构、养分循环、病害防治等密切相关[2]。土壤不健康的一个重要体现是土传病害的流行，它是土壤微生物群落结构失衡和恶化的结果。通过采取有效措施改善土壤微生物结构，特别是改变细菌群落结构，对抗病具有重要作用，如假单胞菌、芽孢杆菌和农杆菌有促进作物生长和增强抵抗病原菌的功能[3]。【前人研究进展】张凯煜等[4]研究表明有机肥能提高细菌数量及多样性，不同施肥措施显著改变了细菌群落结构。涂勇等[5]研究发现大豆与烤烟套作显著增加细菌和放线菌的数量，降低烤烟土传病害的发生，且病害的发生与根际土壤细菌和放线菌的数量显著负相关，与真菌数量极显著正相关。阳显斌等[6]研究表明烟蒜轮作与套作根际土壤细菌含量高于单作烤烟，解磷解钾菌含量在烤烟中后期也高于单作烤烟，研究只检测了实验室可培养微生物，没有检测烟田土壤微生物群落结构。【本研究的切入点】本研究利用高通量测序技术，分析健康烟田和烟蒜轮作土壤细菌的群落结构，以及大蒜对后期烟草生长过程根际土壤细菌的群落结构和多样性变化，探讨烟田健康土壤细菌的群落结构特点以及大蒜对烟株根际土壤细菌的影响。【拟解决的关键问题】为寻找烟草土传病害有效的生物防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 烟田概况与取样

试验田为四川凉山州德昌县德州镇凤凰村4社，经度102°11′17″，纬度27°25′40″，海拔1560 m。编号2_1的为健康烟田(往年平均发病率5 %，几乎不发病)，种烟前空闲，土壤pH值为5.50。2_2为易感病烟田(往年平均发病率为50 %)，主要是黒胫病及根腐病混合发病，前茬为大蒜，土壤pH值为5.22。分别于烟草移栽前、旺长期和成熟期采土样，按5点取样法，移栽前取5～30 cm土壤，旺长期和成熟期取根际土壤，将土壤混匀取约1 kg，每个试验田取3个平行样，分别编号。部分土壤风干过筛用于土壤理化性状及酶活的测定，部分装离心管-20 ℃冷冻保存，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S多样性基因测序和分析。土样基本理化性状如表1所示。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤理化性质测定方法 按照土壤理化分析方法检测pH值、含水率、有机质、全氮和土壤养分[7]。

1.2.2 土壤微生物DNA提取及基因测序 根据陈乾锦等[8]研究的DNA提取和测序方法进行16S土壤细菌基因测序。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 22软件进行方差分析。基因测序结果利用上海美吉生物医药科技有限公司云平台软件进行分析。

表1 烟田理化性质

表2 各样本OTU聚类和物种分类谱系

*为0.01

2 结果与分析

2.1 根际土壤细菌多样性

如表2所示，移栽前健康土壤样本(Y2_1)种类比易感病土壤低，说明种植大蒜增加了土壤细菌丰富度。种植烟草以后细菌种类都降低，2个试验田基本一样，到成熟期有所提高，易感病土壤样本(C2_2)低于移栽前水平，健康土壤样本(C2_1)在属水平以后比移栽前显著升高，之前水平都比移栽前低，易感病烟田略高于健康土壤。可以看出，种植大蒜后烟田土壤细菌群落的自我调控能力大大提高，虽然没有调整到移栽前水平，但比成熟期健康土壤稍高。

各样本的Alpha多样性差异检验如图1所示。从sobs指数可以看出，健康土壤在3个生长时期之间存在显著差异性，易感病土壤在3个时期之间有极显著差异，同时期在健康和易感病烟田只有移栽前样本之间有显著性差异。Shannon指数评价物种群落组成的均匀度，表示群落多样性，从香农指数差异分析可以看出，移栽前和旺长期之间有显著差异，易感病烟田的移栽前和成熟期之间有极显著差异，健康烟田有显著差异。Sobs指数和香农指数显示，在同一时期健康和易感病之间没有显著性差异，说明烟草生长时期对于烟田土壤细菌总数和多样性影响较大，健康与易感病土壤之间有差异但不显著。Ace指数和Chao 1指数反应群落物种丰富度，只是计算方法不同，所以差异性也基本相同，健康烟田旺长期和成熟期之间有极显著差异，易感病烟田3个时期之间有极显著差异，健康与易感病烟田之间，在移栽前有显著差异，成熟期有极显著差异。

2.2 土壤细菌群落结构

如图2(见封三)所示，8个样本细菌共检测到35门、88纲、192目、389科、837属、1848种。在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Saccharibacteria、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)10个菌门的相对丰度超过1 %，占总菌数的97 %以上。相对丰度含量高于5 %的优势菌门有变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和酸杆菌门5种，总含量在83.31 %～88.98 %，在健康烟田稍高于易感病烟田。变形菌门和拟杆菌门在种上烟后增加，健康土壤增加的多，放线菌门则减少，健康土壤减少的少。整个生理期健康土壤的厚壁菌门和芽单胞菌门均比易感病土壤少，种上烟后，健康土壤先减少后增加，易感病烟田一直增加，特别是厚壁菌门增加显著，Saccharibacteria种上烟草后显著增加，同一时期健康土壤相对含量低于易感病烟田。

在纲水平上，相对含量大于1 % 的有21种，占总菌数的94 % 以上，其中健康烟田相对丰度高于易感病烟田的优势菌纲有：Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gemmatimonadetes，健康烟田显著低于易感病烟田土壤的有：Acidobacteria、Ktedonobacteria。在目水平上有43种菌相对含量高于1 %，占总菌数的88 %以上，含量在前5的菌有Rhizobiales、Sphingomonadales、Micrococcales、Frankiales和Bacillales，其中种上烟后显著增加且易感病烟田相对含量比健康烟田高的有Sphingomonadales和Bacillales，分别属于变形菌门和厚壁菌门。在科水平上有53种菌含量大于1 %，占总菌数的75 %以上，前5种菌为Sphingomonadaceae、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Xanthomonadaceae、和Acidobacteriaceae_Subgroup_1，种上烟后显著增加且高于健康烟田的有Sphingomonadaceae和norank_p_Saccharibacteria。有显著差异，易感病烟田相对含量高。Acidothemus、Bacillus、norank_o_Saccharibacteria、Candidatus_Solibacter、norank_o_SC-I-84和norank_f_HSB_OF53-F07在属水平上，有54种细菌相对丰度大于1 %，占总菌数的60 %以上，前5种菌属有Sphingomonas、norank_o_Gaiellales、norank_p_Saccharibacteria、Bacillus、norank_o_C0119，分别属于变形菌门、放线菌门、Saccharibacteria、厚壁菌门和绿弯菌门。其中Sphingomonas(鞘脂单胞菌属)、norank_p_Saccharibacteria和norank_o_C0119在种上烟后显著增加，且在易感病烟田高于健康烟田土壤，Bacillus(芽孢杆菌属)种上烟后稍有增加，整个生理期都是易感病烟田高，相对丰度较小的有益菌Bradyrhizobium(慢生根瘤菌属)和Streptomyces(链霉菌属)则在健康土壤高于易感病土壤。

图3 土壤样本非度量多维尺度分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling of soil samples

2.3 土壤细菌群落结构Beta多样性分析和差异分析

如图3所示，Stress值显示结果具有代表性，健康烟田和易感病烟田样本之间具有差异性，种上烟以后，旺长期和成熟期的样本分别聚在一起。移栽前的2个烟田分别在2个区间，相距较远，种上烟以后的区系结构也有较大的差距，到成熟期相距较近。

移栽前，Nitrospirae(硝化螺旋菌门)有极显著差异(图4-A)，易感病烟田土壤相对含量高，但硝化螺旋菌门的相对含量低于1 %，Saccharibacteria有极显著差异，健康烟田土壤比易感病烟田高48.6 %，Gemmatimonadetes、Bacteroidetes和Latescibacteria具具有极显著差异，Rhodanobacter和norank_f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1_具有显著差异，Rhodanobacter、Bacillus和norank_o_SC-I-84在易感病烟田高于健康烟田土壤，其它菌属则是健康烟田土壤高。说明种植大蒜的易感病烟田土壤有益菌增长，且与健康烟田土壤差异显著。

旺长期，Armatimonadetes具有极显著差异，Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes和Firmicutes具有显著差异(图4-B)，norank_o_JG30-KF-AS9和Gemmatimonas具有显著差异，这些菌都是易感病烟田土壤高。

在成熟期，Nitrospirae具有极显著差异，易感病烟田土壤相对含量高，Proteobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia具有显著差异，后2种菌门在易感病烟田土壤相对含量高，变形菌门在健康烟田土壤高。在属水平上，Terrabacter具有极显著差异，在健康烟田相对含量高，Bacillus、norank_o_Gaiellales、norank_o_C0119和Bradyrhizobium具有显著差异，前3种菌属在易感病烟田土壤相对含量高，慢生根瘤菌属在健康烟田高。菌属差异分析显示种植大蒜后的易感病烟田土壤提高了调节和维持有益细菌丰度的能力。

2.4 土壤细菌群落结构土壤理化性质和酶活的相关性

由图5所示，环境因子对主要门分类水平细菌群落的冗余分析，第一主轴解释了细菌门群落60.47 %的方差变化，第一和二主轴共解释了82.97 %的方差变化。蔗糖酶INV(P=0.003)、有机质OM(P=0.001)和碱解氮AN(P=0.001)是对门水平细菌群落具有极显著正相关的环境因子，蛋白酶PR(P=0.012)、总氮TN(P=0.046)和速效磷AP(P=0.022)则是具有显著负相关的环境因子。其它环境因子对细菌群落结构也有影响但未达到显著水平，大部分细菌与脲酶URE、pH正相关，与酸性磷酸酶ACP、速效钾AK、总磷TP呈负相关。

图4 烟草不同时期烟田土壤细菌在门水平和属水平上的差异分析Fig.4 Difference analysis of bacteria at phylum and genus level in soil of tobacco field

相对含量超过1 % 前10种细菌门与土壤酶活和理化性质的spearman相关性分析具体如表3所示，酶活与细菌的相关性，ACP与这10种细菌门都没有相关性，蛋白酶和蔗糖酶对细菌丰度的影响较大。PR与Saccharibacteria极显著正相关，其余是显著负相关，INV对变形菌门和Saccharibacteria极显著负相关，与绿弯菌门极显著正相关，与放线菌门和酸杆菌门显著正相关，而URE对变形菌门和厚壁菌门显著正相关，与绿弯菌门显著负相关。理化性质与细菌的相关性，pH与前10种细菌门没有相关性，OM、TN、AN和AP对细菌丰度的影响较大。OM与Saccharibacteria极显著负相关，与变形菌门显著负相关，与芽单胞菌门和放线菌门极显著正相关，总氮与Saccharibacteria极显著负相关，与芽单胞菌门极显著正相关，与浮霉菌门显著正相关，AN与变形菌门和Saccharibacteria极显著负相关，与放线菌门和芽单胞菌门极显著正相关，速效磷与Saccharibacteria极显著负相关，与芽单胞菌门极显著正相关，与浮霉菌门和疣微菌门显著正相关。AK和TP只与厚壁菌门极显著正相关。放线菌门与主要相关的理化性质呈极显著正相关，变形菌门与INV和理化性质极显著负相关，厚壁菌门只与速效钾和总磷极显著正相关，厚壁菌门在易感病烟田一直高于健康烟田土壤，特别是种上烟后，增加显著，这与养分的变化一致(表4)，而Saccharibacteria与INV和理化性质极显著负相关，芽单胞菌门与主要理化性质极显著正相关，与PR极显著负相关。

PR：蛋白酶，INV：转化酶，URE：脲酶，ACP：酸性磷酸酶，OM：有机质，TN：总氮，AN：碱解氮，AP：有效磷，AK：速效钾，TP：总磷图5 细菌门分类水平与环境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis(RDA)of bacteria at phylum level and environmental factors

3 讨论与结论

作物土传病害病原菌是土壤微生物群落的组成部分，健康土壤微生物群落一方面可抑制植物病原菌过度地繁殖，另一方面可酶解产生诱导物质诱导植物产生并积累大量次生抗病物质，提高作物的抗病性[9]。不健康土壤微生物群落失衡，某些种类微生物大量繁殖，使微生物多样性降低。土壤微生物多样性对维持农业生态系统的平衡具有重要作用，随着高通量测序技术的发展，成本降低、准确性高、灵敏度高，实现大规模的土壤微生物基因的直接测序，有助于研究土壤微生物的丰富度和多样性，为有效防控土传病害提供数据支撑[10]。

表3 细菌门水平上的群落结构与土壤酶活和理化性质的相关性分析

表4 移栽前和旺长期土壤养分变化

本研究发现土壤细菌的微生物总数和多样性在烟草不同生长时期有显著差异，在移栽前和成熟期，健康烟田和易感病烟田之间的多样性达到显著差异。前茬作物对土壤细菌的总数和多样性影响较大，种植大蒜的易感病烟田土壤高于健康烟田，与张笑宇等[11]的研究结果一致。旺长期土壤总数和多样性就大幅度下降，且多样性低于健康烟田，到成熟期又升高，土壤细菌总数和多样性都高于健康烟田，说明易感病烟田种植大蒜后再种烟，对土壤细菌数量和多样性的调节能力提高，已趋于健康烟田土壤。在门水平上，优势菌门变形菌门、拟杆菌门和放线菌门在健康土壤含量高于易感病土壤，厚壁菌门和芽单胞菌门则低于易感病烟田土壤，厚壁菌门与健康烟田差异显著。在属水平上，非优势菌属的链霉菌属在健康烟田比易感病烟田高约2倍，具有清理土壤有毒物质的鞘脂单胞菌属[12]则是易感病烟田比健康烟田高约1倍。而优势菌属中的鞘脂单胞菌属和芽孢杆菌属则一直是易感病烟田土壤高，芽孢杆菌属的差异达到显著水平。

有研究表明，土壤的抗病能力与根际土壤中变形菌门和放线菌门相对丰度呈正相关[13]，这可能是由于其中部分微生物具有较强的抗病能力。变形菌门细菌为嗜营养菌菌，能以很多有机物和植物残体为碳源和氮源，所以施用有机肥可以刺激变形菌门的生长，从而提高作物抗病性[14]。放线菌门可产生多种抗生素和胞外酶，对植物病害具有防御作用[15]。地杆菌属为放线菌门，是根际土壤的氢氧化细菌，作为植物的根际促生菌的一种，对农作物具有增产的作用[16]。慢生根瘤菌属是变形菌门的一种根瘤菌，具有固氮作用，可自生固氮，也可与豆科植物共生固氮，但只在植物营养缺乏时才能进行固氮作用[17]。芽孢杆菌属为厚壁菌门，其中有很多益生菌种，对土壤病原真菌具有强烈的抗性[18]，在防治作物病虫害和修复土壤重金属污染方面有诸多研究，近几年研究发现其还能有效控制根结线虫[19]。本研究中，移栽前和种上烟后土壤细菌群落之间差异显著，健康烟田和易感病烟田土壤之间差异也显著。移栽前由于前茬作物不同，优势菌门中的芽单胞菌门和拟杆菌门有显著差异，易感病烟分别比健康烟田高23.6 %和67.5 %，芽孢杆菌属有极显(P≤0.001)著差异，在易感病烟田比健康烟田高1倍多，说明种植大蒜有益细菌门增加，有利于土壤细菌群落结构的调整。种上烟草后虽然优势菌门种类不变，但是有差异的菌种与移栽前不同，旺长期厚壁菌门、芽单胞菌门和芽单胞菌属具有显著差异，易感病烟田均比健康烟田高约1倍，成熟期则是变形菌门、厚壁菌门、慢生根瘤菌属和芽孢杆菌属有显著差异，地杆菌属有极显著差异，变形菌门、慢生根瘤菌属和地杆菌属在健康烟田比易感病烟田高9.5 %、64.2 %和92.8 %，厚壁菌门和芽孢杆菌属在易感病烟田高62.2 %和57.9 %。说明易感病烟田种植大蒜后对烟株根际土壤细菌调节作用维持时间较长，促进烟草根际环境中有益细菌的生长，最终使得这一年的发病率大大降低(仅为6.5 %)。

土壤微生物中有优势菌门与环境因子的分析表明，蔗糖酶、有机质和碱解氮是影响细菌群落变化的主要因子，而蔗糖酶活性与有机质具有正相关性，这与张凯煜[4]等的研究一致，大量的研究结果证实土壤氮含量和有机质含量显著影响细菌群落结构，施用有机肥可以显著提高土壤细菌的数量和多样性。本研究表明通过大蒜轮作也可以提高有益细菌的含量和多样性，易感病烟田的厚壁菌门和芽单胞菌门数量显著增加，比健康烟田还高，且厚壁菌门和芽孢杆菌属与健康烟田土壤含量的差异达到显著水平。但是细菌群落改善对抗病的机理研究，还需要进一步比较分析烟草根际微生物种群的代谢变化才能真正揭示。