代谢组学在胰腺外分泌疾病中的研究进展

唐曦平

广西医科大学附属肿瘤医院内镜中心，南宁 530021

【提要】 胰腺疾病可导致机体出现严重的代谢紊乱，而反映生物信息终端事件的代谢组学研究则能够系统、全面地体现疾病状态下机体发生的变化。因此，应用代谢组学技术研究胰腺外分泌疾病的发病机制，有助于疾病的早期诊断及治疗。

代谢组学(metabolomics 或metabonomics)是后基因组时代发展起来的一门新兴的组学技术，最早于20世纪末由Nicholson等[1]和Fiehn等[2]相继提出，其与基因组学、转录组学、蛋白质组学共同构成系统生物学整体。代谢组学的具体定义是指定量测定生物系统对病理生理刺激以及基因改变产生的多参数代谢的动态应答，分析对象是细胞、组织或器官中低分子量(50～2 000)代谢产物的集合[3-4]。由于代谢产物处于生物信息传递的终端，反映的是已经发生了的生物学事件，基因表达和蛋白质的变化对系统产生的影响都可在代谢物水平上得到体现，因此代谢组学强调的是机体整体的变化，是所有代谢应答的全貌和动态变化的过程。与基因组学和蛋白组学相比，代谢组学不仅更能表现出生物体系整体功能或状态的最终结果，并且放大了基因和蛋白表达的微小变化，从而使检测更容易；研究不需进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；代谢产物的种类远少于基因和蛋白质的数目，且代谢产物在各个生物体系中都是相似的，研究中采用的技术更通用[5]。代谢组学的基本研究方法是通过高通量高分辨率的检测技术，对代谢产物进行测定，得到海量数据集，再通过数据分析得到有差异的代谢物质，并寻找其代谢通路，解释其生物学意义。

一、代谢组学技术

目前代谢组学技术应用最广泛的是核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)、色谱法和质谱法及其联用技术，包括气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)和液相色谱-质谱(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)。

1．NMR：NMR是代谢组学的常用检测技术之一，特别是1H-NMR。其优点是样品前处理简单，样品用量少，无损伤性，无偏向性，对所有化合物的灵敏度一样，能完成代谢产物中大多数化合物的检测。但其缺点是灵敏度、分辨率较低，不适用于大量低丰度代谢物的分析。近年13C-NMR的应用提高了其分辨率[6]，进一步拓宽了NMR 技术的应用领域，广泛应用于药物毒性、生理病理过程机制研究以及疾病的临床诊断。

2．色谱-质谱联用技术：与NMR相比，色谱-质谱联用技术具有较高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，兼备色谱的高分离度、高通量及质谱的普适性、高灵敏度和特异度等特点，具有检测分离模式多样、变量与代谢物直接相关等优势，逐渐成为代谢组学研究中最主要的分析工具之一。(1) GC-MS技术：GC的高效分离结合MS的结构鉴定功能，使GC-MS具有高精密度、高灵敏度及经久耐用性[7]，可以同时测定几百个化学性质不同的化合物。与LC-MS相比，GC-MS的优势在于可以从标准谱图库中获得化合物结构信息，对代谢物易于定性，适合对挥发性物质的研究；缺点是样品需做衍生化处理才能得到较多的代谢组分信息[8]，从而使得样本前处理过程不仅复杂繁琐，可能也会导致某些物质信号的丢失。(2)LC-MS技术：相对于GC-MS，LC-MS能分析更高极性和更高相对分子质量的化合物，主要应用于临床疾病诊断、部分疾病生物标志物的发现等，并可通过对代谢物结构的鉴定，对样本进行针对性和细致的分析，非常适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定，已被越来越多地用于代谢组学研究[9-10]。尤其是超高效液相色谱(ultra performance liquid chromato-graphy，UPLC)技术的样品前处理简单，对待测组分的挥发性和热稳定性没有要求，不需繁琐的衍生化步骤，可进行快速高效的检测[11]。其缺点是缺少可以参考的标准谱图数据库，代谢物鉴定需借助标准品，鉴别相对困难。但LC-MS 虽然缺少可以参考的标准谱图数据库，却可以通过它获得代谢物精确的分子质量数，再通过数据库进行检测确定分子的结构信息[12]。

3．多种分析平台的联合应用：代谢物本身具有多样性与复杂性的特点，而每种分析平台都存在自身的局限性，目前并没有一个单一的技术可以同时测定和识别样品中所有的代谢物，所以需综合各分析平台的数据以得到更全面的代谢物信息[13]。例如，为了覆盖更广泛的代谢物，Naz等[14]首次将多种互补分析技术成功应用于患有败血症的大鼠肺组织，并且证明了在代谢组学研究和生物标志物发现中应用多平台方法的重要性。Jung等[15]应用NMR和UPLC-MS 相结合的分析方法分别测定了两种不同处理方式的黄芪根样本，结果显示去皮根的某些主要代谢物显著损失，表明该技术为中药材采收及处理后评估分析有效成分提供有力工具。Ibanez等[16]运用多平台分析技术研究膳食多酚对人类结肠癌细胞的抗增殖作用，发现多酚类代谢产物呈现显著差异，同时证明了这种多分析平台由于其互补性质而提供了广泛的代谢信息和覆盖范围。因此，将多种分析技术的代谢组学数据进行整合，既可提供更全面的代谢物轮廓信息，使结果更完善，也使不同分析技术的结果得到互相验证，达到分析平台优势互补[17]。

二、代谢组学在胰腺外分泌疾病中的相关研究

胰腺是重要的消化器官，与蛋白质、糖类、氨基酸、脂类代谢密切相关，一旦胰腺发生疾病，会引起人体营养物质代谢严重紊乱。因此，应用代谢组学技术研究胰腺疾病的发病机制，有利于实现早期诊断或进行药物疗效观察。

1．代谢组学在AP中的相关研究：AP是消化内科常见疾病，起病急，如不及时干预治疗，常发生SIRS，从而引发高分解代谢状态，导致能量需求和蛋白质分解代谢增加[18]，因此AP患者伴有严重的代谢紊乱，而代谢紊乱状况会进一步扰乱氨基酸、葡萄糖和脂质代谢，从而导致组织和器官损伤的并发症。动物实验表明即使在组织损伤发生之前，胰腺炎症的存在也会引起代谢物(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脂质和牛磺酸)水平的改变，因此检测代谢物水平有助于更好地了解患者病理生理状况，从而有助于早期诊断疾病[19]。不同的代谢组学技术应用于检测大鼠AP模型尿液[20]、小鼠高脂血症性AP模型血清[21]，表明模型构建后血尿中代谢物的主要成分发生了变化；高分辨液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术被应用于中药治疗前后AP模型大鼠血清的研究，发现了一些显著差异的可能生物标志物，包括甘油、谷氨酸、低密度脂蛋白、饱和脂肪酸、丙氨酸和谷氨酸酰胺等[22-23]。在临床研究中，GC-MS被用于检测AP患者血清并确定了一些潜在生物标志物[24]；应用超高效液相色谱-高分辨率质谱(ultra performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)分析显示8种代谢产物(鞘氨醇、辛酰胆碱、甘氨胆酸、肉豆蔻酸、癸酰胆碱、十二烷醇、2-十四烷酮和L-甲状腺素)在MAP患者血清中明显增高，且其中4种还可随着病情好转而下降，从而可用作病情变化的动态监测指标[25]；Villasen等[26]应用NMR同时分析AP患者尿液和血浆的代谢表型，证实由鸟嘌呤、马尿酸或肌酸(尿液)以及缬氨酸、丙氨酸、脂蛋白(血浆)组成的组合生物标志物在AP中具有很强的诊断和预后潜力。以上研究表明，代谢组学在AP中的新发现，尤其是氨基酸与脂类代谢的变化为未来AP机制的研究提供了可能方向。

2．代谢组学在胰腺癌和CP中的相关研究：胰腺癌是癌症相关死亡的第四大常见原因，5年生存率<5%[27]。由于诊断延迟和治疗方案进展缓慢，预计到2030年胰腺癌将成为癌症相关死亡的第三大原因[28]。其致死性可归因于晚期诊断以及对常规放、化疗的几乎完全抵抗性，因此为了能够早期诊断胰腺癌，对可靠诊断生物标志物的研究和定义仍然是一个受到极大关注的主题。胰腺肿瘤细胞的生长可以引起胰腺内外分泌功能异常，导致机体能量、脂肪及氨基酸代谢状态的改变，同时为适应肿瘤组织引起的代谢异常，机体又出现一定的代偿，最终引起血液、尿液及组织在代谢组分上的改变。通常在癌变过程中，基因和代谢物的异常变化都先于组织形态变化的发生，因此检测这些异常变化将有助于肿瘤的早期诊断。迄今为止，国内外已开展了多项关于代谢组学与胰腺癌的研究。Michálková等[29]通过应用1H-NMR光谱对胰腺癌患者和健康对照者的血浆样品进行检测，研究胰腺癌诱导的代谢变化，结果提示，3-羟基丁酸盐和乳酸盐的水平差异有统计学意义，该结果(100%灵敏度，90%特异度)清楚地显示了1H-NMR光谱在胰腺癌诊断中的潜力。Schmahl等[30]应用NMR光谱比较5、11、15月龄的对照组及胰腺癌组小鼠尿液、血清、粪便提取物和胰腺组织提取物的代谢特征，检测胰腺癌的癌前胰腺上皮内瘤变，确定了潜在的生物标志物(尿液：3-吲哚氧基硫酸盐、苯甲酸盐和柠檬酸盐减少；血液：葡萄糖、胆碱、乳酸盐、苯丙氨酸和苯甲酸盐减少；粪便：乙偶姻增加)。Shu等[31]对226例胰腺癌患者及其匹配的健康对照者搜索胰腺癌风险的循环代谢生物标志物，确定了4种与胰腺癌相关的代谢物，并且进一步表明甘油磷脂的失调可能在胰腺癌发展中起重要作用。

CP是胰腺癌的高风险因素，约5%的CP患者发展为胰腺癌[32-33]，但两者均以过度反应性的基质或结缔组织为特征。在影像学的诊断过程中两者经常相互混淆，给疾病的鉴别和诊断带来了很大困难。代谢组学为寻找早期区分二者的非侵入性诊断性标志物开拓了更广阔的前景。在一项大规模研究中，包括271例胰腺癌和282例CP在内的914例受试者的血清和血浆经过LC-MS和GC-MS检测与验证分析，确定了29个代谢产物在CP和胰腺癌之间存在明显差异，且预测CP患者中胰腺癌的发生率可以达到1.95%，其优化预测值达到99.9%[34-35]。Lindahl等[36]使用基于LC-MS的代谢组学发现甘氨胆酸、N-棕榈酰谷氨酸和己酰基肉碱3种单一代谢产物以及加上苯乙酰谷氨酰胺、鹅去氧甘构成的一个5种代谢物组合在两个独立的队列中可以作为区分CP和胰腺癌的标志物。

三、结语

AP、CP及胰腺癌发病率逐年提高、胰腺癌早期诊断方法有限、CP与胰腺癌鉴别困难以及这些胰腺外分泌疾病与机体代谢改变关系密切等因素，使代谢组学在胰腺疾病中的研究成为势不可挡的新方向。代谢组学作为一种新兴的系统生物学技术，因其简便无创、高通量、高精确性及高灵敏度的特点而迅速成为多学科、多领域研究的热点，近年在胰腺疾病的研究中也有了一些新的进展，但目前仍然具有一些不足之处，例如分析技术还不够成熟、不同检测分析技术的缺陷、收集的生物信息量过于庞大、数据建模和挖掘不充分等。随着多种技术的进一步革新发展，更高通量、高灵敏度的检测技术与更高效的数据分析方法的整合应用，以及代谢组学与各组学技术的联用等，相信代谢组学技术在胰腺外分泌疾病的诊断、发生发展机制及治疗中的应用将会有突破性的进展。

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