组蛋白乙酰化酶及其抑制剂在骨关节炎中的作用与机制研究进展

马维邦 孙红 代云磊 沈茂

骨关节炎 ( osteoarthritis，OA ) 是一种以关节软骨退行性变、软骨下骨骨质增生为特征的慢性、退行性关节疾病，而软骨细胞外基质代谢紊乱是关节软骨病理改变的关键环节[1]。大量的研究发现，组蛋白乙酰化酶 ( histone deacetylases，HDACs ) 直接调控软骨细胞组蛋白乙酰化水平，进而影响细胞活性以及调控软骨细胞外基质表达，从而在骨关节发生、发展中扮演着重要的角色[2]。相反，组蛋白乙酰化酶抑制剂 ( histone deacetylase inhibitors，HDACi )其作用于软骨细胞不同的信号通路，进而发挥抗炎、抑制软骨细胞外基质降解的作用[3]。现对 HDACs 及 HDACs 抑制剂在骨关节分子机制中的作用综述如下。

一、组蛋白乙酰化酶概述

组蛋白乙酰化是一种动态的细胞过程，而这一过程受到两个独特的酶家族即 HDACs 和组蛋白乙酰转移酶( histone acetylases，HATs ) 的调控作用。HDACs 和 HATs已经被证明可以直接参与组蛋白乙酰化，进而介导转录调控和翻译后修饰[4]。组蛋白的乙酰化主要发生在赖氨酸残基上，赖氨酸侧链含有氨基，在生理条件下带正电荷，从而能够和含有磷酸基团的 DNA 紧密结合组蛋白。乙酰化后无法与 DNA 紧密结合，使得染色质结构松散，从而促进相关基因的表达[5-6]。在细胞核内，HDACs 能够移除组蛋白上的乙酰基，组蛋白乙酰化、染色质蜷缩，包绕在组蛋白周围的 DNA 之间的空间变小。转录因子难以与蜷缩的染色质结合，从而抑制靶基因转录和细胞内多种信号通路[7-8]。

HDACs 是由 18 个酶组成的家族，根据其与酵母的同源性分为四类[9]。其中 I 类、II 类和 IV 类 Zn2+依赖性HDAC，由 11 个家庭成员组成，称为“经典”HDACs[10]。I 类 HDACs 与酵母 RPD3 基因同源，成员包括 HDAC 1、2、3、8。II 类与酵母 HDA1 基因同源，成员包括 HDAC 4～7、9、10，IV 类仅有一个成员，即 HDAC 11[11]。I 类HDACs 分子约由 400～500 种氨基酸组成，其中 HDAC 1～3 位于细胞核内，HDAC8 穿梭于细胞核与细胞质之间。I 类 HDACs 分子几乎表达于人体所有类型细胞中。II类 HDACs 分子约由 1000 种氨基酸组成，除 HDAC6 定位于细胞质外，HDAC4 / 5 / 7 / 9 可在特定的细胞信号引导下穿梭于细胞核与胞质之间。II 类 HDACs 分子的表达具有一定的组织特异性与细胞特异性。IV 类 HDAC 分子位于细胞核种，其结构与 I 类 HDACs 分子相近。

III 类 HDACs 分子即是 Sir2 相关酶类 ( Sir2-related enzymes，Sirtuins )，也称为“沉默信息因子”。III 类HDACs 分子是 HDACs 家族中比较特殊的一类，由 Sirt1～7 组成，具有尼古丁腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 依赖性，因而不受 Zn2+结合类 HDACi 抑制。III 类 HDACs 分子其在在细胞代谢中多个环节调控发挥着重要的作用，诸如 DNA修复、炎症反应、细胞凋亡[12-13]。

二、“经典”HDACs 在软骨退变中的作用

HDACs 通过对多种酶类及信号通路的调控，在软骨细胞外基质代谢和软骨发育过程中起着关键作用[14]。据报道，I 类 HDACs ( HDAC1，2，3 和 8 ) 可抑制软骨特异性基因表达，打破软骨的降解与生成平衡，从而抑制软骨形成、加速软骨退变[15]。而抑制 I 类 HDACs 表达可以抑制IL-1β 诱导的基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases，MMPs ) 表达，进而减缓软骨细胞外基质降解[16]。有研究发现，软骨细胞内 HDAC1、HDAC2 的含量越高，其对二型胶原 ( type II collagen，COL2A1 )、聚蛋白多糖 ( aggrecan，ACAN ) 和软骨寡聚基质蛋白 ( cartilage oligomeric protein，COMP ) 等软骨特异性基因抑制作用就越强[14]。Mao 等[17-18]证实 HDAC2 / 8 均参与了关节软骨基质降解，使用 miR-95-5p 和 miR-92a-3p 抑制 HDAC2 / 8 表达，可增强软骨基质合成代谢相关标志物表达。

在 HDAC3 敲除或 HDAC3 抑制剂预处理的软骨细胞中，Akt 及其底物的磷酸化减少与磷酸酶 Phlpp1 的表达增加有关。深入研究表明，HDAC3 抑制 Phlpp1 表达、提高 Akt 活性，从而加速了软骨细胞肥大同时减少软骨基质的产生，使软骨细胞形态发生改变[19]。Meng 等[20]研究表明，miR-193b-3p 可直接抑制 HDAC3 表达，从而促进组蛋白 H3 乙酰化，正向调节骨髓间充质干细胞成软骨分化和软骨基质代谢。

II 类 HDACs 具有在细胞核和细胞质之间穿梭的能力。HDAC4 作为软骨细胞肥大和成骨细胞分化的关键调控因子，可通过与 Zfp521 和 Mef2c 的相互作用调控软骨细胞肥大[21-22]。不仅如此，HDAC4 可作为中间分子参与了雷帕霉素复合物 1 ( mTORC1 ) 诱导的 miR-483-5p 表达升高，刺激软骨细胞肥大、细胞外基质降解以及软骨下骨血管生成，从而启动和加速骨 OA 的发展[23]。然而，也有研究表明 HDAC4 过表达能降低 IL-1β 刺激大鼠软骨炎症模型中 RUNX-2、MMP-13 和 X 型胶原水平，同时上调 II型胶原和 ACAN 的表达水平，提示 HDAC4 可能参与减缓OA 疾病进程[24]。但多数证据表明，HDAC4 主要参与软骨基质分解代谢，促进软骨退变[23,25-26]。

据报道，HDAC7 在 OA 患者关节软骨中表达升高，而其高表达可通过促进 MMP-13，进而导致软骨细胞外基质降解[27]。不仅如此，HDAC7 还能抑制软骨细胞增殖活性，降低软骨细胞中 HDAC7 水平促进软骨细胞增殖和软骨组织再生[28-29]。另外，来源于颞下颌关节滑膜间充质干细胞中 HDAC10 过表达可促进 IL1-β 所诱导的 NF-κB 信号通路活化以及炎症介质 IL-6 和 8 释放，从而加速颞下颌关节 OA 发生[30]。

三、沉默信息因子在软骨退变中的作用

一般而言，Sirts 可促进软骨特异性基因表达、抑制软骨细胞凋亡，从而抑制关节软骨退变以及细胞外基质降解。据报道，关节软骨中 Sirt-1 的表达水平与关节软骨退变的严重程度呈负相关，提示 Sirt-1 可作为一种潜在的预测膝关节退变的分子标记物[31]。Sirt-1 也是促进软骨细胞增殖的关键因子，其可促进软骨细胞外基质合成代谢基因表达而抑制分解代谢基因表达[32-33]，而体内试验表明Sirt-1 表达升高可阻止小鼠模型中 OA 的进展[34]。OA 软骨细胞中过表达能上调 Bcl-2 蛋白并降低 Bax、MMP-1 和MMP-13 表达以及降低 p38、Jun N-terminal 激酶 ( JNK ) 和细胞外信号调节激酶 ( ERK ) 的磷酸化，从而抑制 OA 软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[35]。

Sirt-3 随着年龄的增长而表达逐渐下降，而 Sirt-3 的全身缺失加速了膝关节 OA 的发展。恢复衰老关节软骨细胞内的 Sirt-3 水平可增加体内 SOD2 的活性，缓解软骨细胞氧化应激，从而减缓关节软骨退变[36]。Wang 等证实，Sirt-3 所介导的 PINK1 / Parkin 信号通路参与了二甲双胍对OA 的治疗效应，提示 Sirt-3 是 OA 防治重要分子[37]。而大量研究证实，线粒体稳态是 Sirt-3 参与调控软骨细胞凋亡、基质异常代谢的关键环节[37-39]。

Sirt-6 是沉默信息因子家族的重要一员，其与衰老、代谢以及 OA 等过程密切相关。有研究发现，小鼠体内Sirt-6 表达不足则会导致髌下脂肪垫中炎性细胞因子的表达增加[40]。Wu 等[41]研究发现，Sirt-6 在 OA 关节软骨中表达较正常软骨中表达下降，上调 Sirt-6 能抑制软骨细胞衰老及炎症反应。Nagai 等[42]通过 RNA 干扰 ( RNAi ) 技术降低关节软骨细胞内 Sirt-6 表达水平，则会引起 MMP-1和 MMP-13 表达显著升高。不仅如此，Sirt-6 表达降低，亦可引起 DNA 损伤和端粒功能障碍的增加，进而导致软骨细胞早期衰老。上述研究表明，Sirt-6 可能是一种 OA治疗的潜在靶点。

另外，Korogi 等[43]研究发现，减少小鼠源性 ADTC-5细胞系中 Sirt-7 表达，可促进糖胺聚糖细胞外基质沉积以及二型胶原、ACAN 表达。不仅如此，Sirt-7 还能抑制转录因子 SOX9 活性。Sirt-7 也是一种能调控软骨稳态、影响 OA 进展的重要分子。

四、HDACi 与 OA

Zn2+依赖性的 HDAC 具有 4 个重要的位点结构域，即疏水通道、表面结构域、催化 Zn2+结构域和相邻的内腔。而 HDACi 则主要由 3 个结构域组成，包括占据疏水通道的连接基团、与催化 Zn2+结构域相互作用的 Zn2+结合基团以及与口袋表面相互作用的 Cap 基团[44]。HDACi 是多样化的家族，可分为自然产生的抑制剂和人工合成的抑制剂，作用可逆的抑制剂和不可逆的抑制剂，广谱的抑制剂和选择性抑制剂等。目前认为 HDACi 可以分成四类，包括异羟肟酸类、苯甲酰胺类、环四肽类和短链脂肪酸[45-46]。

HATs 和 HDACs 控制着组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态平衡，参与相应基因表达的转录水平调控，从而影响疾病的发生发展。大量的研究表明，HDAC 抑制剂可拮抗炎性细胞因子诱导的细胞外基质降解，从而抑制软骨破坏、关节软骨退变。关节软骨中 MMPs 表达升高可引起细胞外基质代谢失衡、关节软骨组织降解，最终导致软骨甚至软骨下骨破坏。实验研究表明，HDACi 可抑制关节软骨中 MMPs 的表达。伏立诺他 ( Vorinostat ) 是一种 HDACi，可通过减少关节软骨细胞 IL-6 的释放，抑制 IL-1β 介导的 MMP-13 表达[47]。曲古抑菌素 A ( Trichostatin A )是一种 HDACi，其可在大鼠 OA 模型中关节软骨细胞使MMP-1、MMP-3 和 MMP-13 表达下降[48]。不仅如此，TSA 还可以抑制组织蛋白酶 ( cathepsins ) K / B / L / S 四种酶的表达[49]。Chabane 等[50]研究发现 TSA 能显著抑制IL-1β 引起的炎性细胞因子如 NO、PGE2、TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS 等表达升高，从而减缓软骨细胞炎症反应。此外，HDACi 还能促进 OA 相关的成纤维样滑膜细胞中 miR-146a 表达，从而抑制 IL-1β 诱导的炎症信号通路传导和炎症因子释放，在 OA 进程中发挥抗炎效应[51]。另外，国内学者证实 I 型 HDACs 抑制剂包括TSA、丙戊酸 ( VPA ) 和 MS-275 均能抑制软骨细胞 MMP-1及 MMP-13 的表达，其可能是通过调节软骨细胞外基质异常代谢而发挥对软骨退化的保护作用[52]。

五、相关信号通路

丝裂原活化蛋白激酶 ( MAPK ) 通路是调控多种正常细胞功能的最具特征的信号通路，它通过将来自上游细胞外生长因子的信号传递给位于细胞核内的不同的下游效应物从而调节细胞增殖、分化、存活和凋亡[53]。MAPK 亚家族包括 4 组：P38 MAPK、ERK、ERK5 和 JNK。MAPKs 通路作为多信号转导通路和共享转导通道的中心节点，由三个信号级联通路组成：ERK 1 / 2、p38 和 c-Jun n-末端激酶。促炎细胞因子等刺激会激活 MAPKKK，进而触发MAPKK 基因表达和蛋白磷酸化，最终导致 p38-MAPK 或JNK-MAPK 相关基因表达。MAPKs 信号通路已经被证实与炎症有关。抑制 p38-MAPK 信号通路可以改善炎症引起的细胞损失，减轻软骨细胞凋亡[54]。HDACi 可以通过下调MAPK 信号来抑制 RUNX-2 和 ADAMTS-5 的表达[55]。不仅如此，HDACi 还能通过抑制 MAPK 通路的激活 ( 包括 ERK 1 / 2，p38 和 JNK 1 / 2 )，下调 RUNX-2 转录因子介导的MMP-13、ADAMTS-5 及诱导型一氧化氮合酶 ( iNOS ) 的表达，从而发挥抗炎作用[55-56]。

核因子-2 ( Nrf2 ) 是一种关键的转录因子，主要调节组织损伤中抗氧化酶的表达[53]。据报道，Nrf2 参与 HATs 和HDACs 平衡的调节，而 Nrf2 乙酰化水平与软骨细胞外基质代谢密切相关[57-58]。Khan 等[59]研究发现 Nrf2 通过激活 OA软骨细胞中 ERK 1 / 2 / ELK1-P70S6K-P90RSK 信号通路，减少软骨细胞氧化应激，从而抑制软骨细胞凋亡。上述研究提示，Nrf2 可能成为一种新型的治疗骨关节的分子。

总之，OA 发生发展与 ncRNAs、DNA 甲基化及组蛋白乙酰化等密切相关。表观遗传学的研究有助于阐明 OA发生、发展机制，为 OA 治疗提供新线索。目前，已有研究已证实 HDAC 参与基因表达调控、染色质结构修饰、细胞代谢调节等多种生命过程，对于 HDAC 作用机制的研究可指导药物研发用于临床疾病治疗[60]。HDAC 抑制剂药物研发目前在临床研究取得了一定的成果，多种 HDAC 抑制剂药物被美国 FDA 批准单独或联合其它药物用于多种疾病治疗中，包括靶向治疗，肿瘤、OA、心理疾病、神经退行性疾病等的治疗[61-63]。近年来 HDACi 在 OA 治疗上的研究取得了进一步突破，大量的体内、体外实验及临床研究表明 HDACi 对人类 OA 治疗有确切的疗效[58]。然而，目前在 HDAC 和 HDACi 在 OA 基础及临床研究中仍然存在许多未知，阐明 HDAC 在 OA 病程中的发生、发展机制，进而开发相应的 HDACi，可为骨关节的防治提供一种新的策略。