miRNA 在瘢痕疙瘩中作用研究进展

刘 丽，左 蕊，金 路，刘小嘉，赵鹏宇，向小燕

（1.川北医学院附属医院，四川 南充，637000；2.川北医学院，四川 南充，637000）

瘢痕疙瘩（keloid disease,KD）是伤口异常愈合的结果，具有像肿瘤一样侵入周围正常组织的特点，并无随时间消退倾向。手术切除联合放疗，激光，压力治疗和局部注射药物等是目前主要的治疗方法，但疗效并不十分令人满意。近年来，miRNA成为大家关注的热点，多篇研究表示miRNA在KD 形成过程中扮演着重要的角色。本文主要从miRNA表达改变对角质形成细胞、成纤维细胞及细胞外基质产生影响，进而对KD 的产生起到调控作用进行阐述。

1.miRNA 概述

miRNA是在真核生物中广泛表达，并具有调控功能的内源性非编码的单链小分子RNA，长约21-23个核苷酸，多数miRNA 具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA通过引导其参与合成的RNA诱导的沉默复合体中(RISC)来降解靶基因mRNA或阻碍其转录、翻译[1]。每个miRNA可以有多个靶基因，调控多个基因表达。而多个miRNA也可以共同调节同一个基因，对其进行精细的调控。大量证据表明，miRNA在调节炎症，血管生成，癌症，恶性皮肤病，伤口愈合和纤维性疾病中发挥着重要作用。近年来发现miRNA也影响着KD的形成:1.影响相关细胞因子释放，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)，炎症因子,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF); 2.相关信号通路的传导,如TGF-β/Smad、PI3K/AKT; 3.促进或抑制角质形成细胞及成纤维细胞的生长和功能活动; 4.细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积等。虽然目前，对于KD的形成已有一定的了解，但仍不够全面，而miRNA为揭开其神秘的面纱提供了一条新的方向。因此，期望于研究不同miRNA如何对KD 进行作用，来完善KD的调控网络，尤其对于能靶向作用于KD形成环节多个基因、多个蛋白的miRNA,以及多个miRNA共同调控的信号传导通路，是我们的重点研究对象，为将来研究强有力的预防及治疗药物，开发新的治疗方式奠定了基础。

2.miRNA 在瘢痕疙瘩中的作用

2.1 miRNA 对角质形成细胞的影响：

角质形成细胞（keratinocyte,KC）是表皮的主要细胞，可产生角质蛋白，分泌多种生物活性因子，而这些活性物质可穿过基底层，作用于邻近细胞如成纤维细胞。对于KD，大多数研究都把目光聚焦在成纤维细胞和EMC上，但是通过观察KD 标本我们发现其表皮层相较于正常皮肤表皮明显增厚，且有研究发现瘢痕疙瘩来源的KC 侵袭能力，增殖能力增强，向间充质细胞分化，与成纤维细胞互相作用等，这些都说明了KC在KD 形成中的重要性。有研究发现有miRNA通过影响瘢痕疙瘩来源的角质形成细胞(keloidderived keratinocyte,KK)从而参与瘢痕疙瘩的侵袭和复发，如miR-21-5p 在瘢痕疙瘩的表皮中表达异常，miR-21-5p 过表达通过靶向作用于磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen，PTEN)，激活AKT信号通路来显著增加了KK的迁移，侵袭和成球能力以及EMT[2]。目前国内外关于miRNA作用于KK的研究还很少，但却有大量研究表明，在受伤后的角质形成细胞中有多种miRNA表达异常（例如miR-21[3]、miR-31[4]、miR-126[5]、miR-155[6]、miR-26a[7]），通过调控相关信号通路传导，促进或抑制KC的增殖、迁移及凋亡，从而影响伤口的愈合。瘢痕疙瘩本质上来讲是伤口的病理性愈合，所以是否在瘢痕疙瘩中，这些miRNA在KK中也异常表达，通过影响KK的生物学行为，从而调控着瘢痕疙瘩的形成呢？这仍需要我们进一步去研究探索。

2.2 miRNA 对成纤维细胞的影响：

在KD中，成纤维细胞被认为是主要的效应细胞。成纤维细胞功能的激活，增殖与凋亡的失衡，向肌成纤维细胞分化，迁移和侵袭能力的增加，这些无一不促进瘢痕的发生。大量研究表明，相较于正常皮肤组织，部分miRNA在KD以及KD 来源的成纤维细胞(keloid-derived fibroblast,KF)中表达上调或者下调，影响着KF的一系列生物学活动。

2.2.1 miRNA表达上调

Ying Liu等人发现，miR-21的过度表达降低了FasL（一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子相关细胞因子家族，通过激活凋亡信号传导途径介导细胞凋亡）的水平，FasL抑制了KF中caspase-8的激活，线粒体介导的相关信号通路的传导，从而抑制了随后的CytoC的释放、促凋亡蛋白Bax的表达和凋亡酶激活因子(APAF1)的表达，以及caspase-9和caspase-3的激活，导致KF的凋亡受到抑制[8]。Zhen Rang等通过微阵列分析比较KD和正常皮肤组织表达谱发现，miR-181a在人KD组织和KF中显著上调,miR-181a过表达通过靶向作用于富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2（PHLPP2），从而激活AKT信号通路，增强了KF的DNA合成和增殖，同时抑制KF凋亡[9]。Juan Zhang 等研究发现，miR-31在KD中表达上调，miR-31过表达靶向作用于HIF1AN，使其表达受到抑制，从而激活VEGF，促进KF增殖及细胞周期进程，抑制KF凋亡[10]。

2.2.2 miRNA表达下调

徐至山等通过基因芯片检测表明miR-194-3p 在KD表达下调，随后证明miR-194-3p可以直接与RUNX2（一类主要调节器官形成的转录因子蛋白）结合,抑制RUNX2的活性及其下游迁移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达从而抑制KF迁移[11]。Xiaodong Yao 等发现KD中miR-1224-5p 的基因表达下调，随后通过miR-1224-5p 模拟物转染KF后证明miR-1224-5p 调控着TGF-β1/Smad3信号通路，同时促进Caspase-3和Bax表达而抑制Bcl-2表达，显著降低KF侵袭活性、减少KF的增殖和促进KF的凋亡[12]。Jingjuan Feng 等发现在KD组织和成纤维细胞中的miR-141-3p 相较于正常组织和正常皮肤成纤维细胞其表达下调，而miR-141-3p过表达能作用于生长因子受体结合相关结合蛋白1(GAB1)，导致GAB1下调，明显抑制KF的增殖和迁移，并促进其凋亡[13]。Ye Zhang 等研究发现，MiR-637在KD组织中表达明显降低，miR637表达与Smad3表达呈负相关；当miR-637过表达时，Smad3表达降低，细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、MMP2的表达也随之降低，从而使KF增殖与转移受到抑制[14]。Wenyan Zhu等发现与增生性瘢痕组织和正常皮肤组织相比，KD组织中的miR-188-5p表达明显下调，而miR-188-5p高表达可抑制KF增殖、DNA的合成、迁移和侵袭，此外miR-188-5p高表达使KF中的MMP-2，MMP-9，PI3K和p-Akt的蛋白水平受到抑制，但是这些作用可被PI3K/Akt抑制剂可降低或抵消，因此miR-188-5p 可能通过调控PI3K/Akt/MMP-2/9信号传导在KF增殖和侵袭中起着关键作用[15]。Gang An等发现，miR-205-5p在KD中的表达显著下调，而VEGF表达增加；通过使miR-205-5p高表达后发现VEGF表达降低，KF的细胞活力、细胞侵袭和迁移能力明显下降，细胞凋亡显著增加，这可能是miR-205-5p通过直接靶向作用于VEGF并随后抑制PI3K/Akt途径的结果[16]。Mingyuan Xu 等研究发现人KF中miR-1-3p 和miR-214-5p 表达相较于正常皮肤降低，它们作为KD抑制因子发挥作用，通过抑制ERK1/2和AKT信号传导以及下调TM4SF1表达（一种小分子质膜糖蛋白），抑制人KF增殖、迁移和诱导凋亡[17]。

2.3 miRNA 调节细胞外基质沉积：

ECM过度沉积，如胶原蛋白，纤连蛋白和弹性蛋白，尤其是Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白过度生成，排列紊乱是KD的一大特征。有研究表明，miRNA在ECM的沉积中也起着关键重要。Renpeng Zhou 等研究发现，在KD组织及KF中miR-21显著高表达，miR-21通过抑制Smad7信号传导从而使COL1A1,COL3A1表达增加，促进KD中胶原过度沉积[18]。Kazuya Kashiyama等基于RT-PCR，荧光素酶活性测定等实验发现,miR-196a在KD中表达降低，并通过靶向成纤维细胞中COL1A1和COL3A1基因来增加Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达[19]。

2.4 miRNA 同时作用于成纤维细胞与细胞外基质沉积：

同一miRNA能同时调控成纤维细胞的表达及ECM的沉积。Kai Shi 等发现miR-203在KF 中明显下调，又通过等双荧光素酶报告分析确定miR-203以早期生长反应1（EGR1）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）为靶点，从而使EGR1、FGF2在KF 中高表达，增加了Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白以及a-SMA的表达同时促进了KF增殖、迁移[20]。Rui Wang 等发现miR-152-3p在KD 中显著上调，通过双荧光素酶报告分析结果表明FOXF1基因是其直接靶标，miR-152-3p 通过靶向作用于FOXF1抑制其表达，促进KF增殖、侵袭、以及Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白表达[21]。Qianqian Pang 等研究表明与正常皮肤组织和细胞相比，KD组织及细胞中miR-152-5p 表达显著下调，但通过上调miR-152-5p 发现其具有抗纤维化作用，miR-152-5p 可能通过调控smad3介导的Erk1/2和Akt 信号通路来抑制KF的增殖、减少迁移、促进KF凋亡和降低Ⅲ型胶原蛋白的表达来调节纤维化相关进展[22]。Wei Wu 等发现miR-217的表达在KD中显著降低，miR-217下调通过靶向纤连蛋白信号通路,促进Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达、成纤维细胞生长，同时抑制成纤维细胞凋亡[23]。

2.5 通过调控miRNA 的表达间接抑制KD形成

HuaYu Zhu 等研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激动剂能激活KF中miR-543转录，miR-543又靶向早期生长应答因子-1（Egr1)，抑制其表达，从而抑制人KD 中Ⅰ型胶原蛋白的表达[24]。Xiaoqing Jian 等通过miRNA 微阵列分析来自于曲古抑菌素（TSA）处理72h的KF 生物样本，发现TSA诱导KF中miR-30a-5p 过表达，miR-30a-5p 通过靶向作用于BCL2基因来抑制KF的生长，促进KF凋亡，同时抑制COL1A1的表达[25]。有研究显示，在甲磺酸丁二醇酯诱导下，KF中miR34a 上调，miR34a 是p53的直接靶标，p53通过直接激活miR34a 基因的表达，并与miR34a 强烈相互作用，导致KF凋亡[26]。肉毒杆菌毒素A（BTXA）已被广泛用于治疗KD，但其具体作用机制尚不清楚，近来有学者发现，BTXA可能通过上调miR1587、miR2392，然后靶向作用于ZEB2（锌指结构蛋白的一种），使ZEB2表达下调，从而抑制KF增殖，促进KF凋亡[27]。HuaYu Zhu 等研究发现，癌基因lncRNA-ATB （由TGF-β激活的长非编码RNA，位于14号染色体上）敲除可以使KF中miR-200c 上调，靶向作用于锌指蛋白217（ZNF217），降低ZNF217的表达水平,抑制TGF-β2的自分泌，抑制KD形成[28]。

4 总结

本文通过整理分析发现miRNA 以及其靶基因和相应的分子信号通路共同构建了一个复杂而又精细的庞大网络，共同调控着KD的形成，不仅可以多个miRNA共同作用于一个靶基因，一个信号通路如Smad3、PI3K/Akt 信号通路、也可以一个miRNA可以调控多个靶基因作用于KD的多个环节如miRNA 等，但目前网络尚不完善，有大量的空白需要我们去补充，例如：1.KC对于KD 的形成有着不可忽视的作用，但是在KD中miRNA对KC的影响相关研究却非常缺乏；2.有miRNA被证明在KD 中表达改变，但对其靶基因，相关分子信号通路，以及在KD 的具体作用仍不清楚；3.针对部分已明确对KD 的作用机制的miRNA，是否除了研究证明的调控通路外，还有另外的调节通路；4.通过整理发现几乎与KD 相关的miRNA均参与着肿瘤的形成，那么是否其他参与肿瘤形成的miRNA也在KD中发挥着作用，甚至有着共同的靶点呢？；5.此外，有研究表明IncRNA可以作为miRNA的来源、还能通过吸附miRNA来靶向降解mRNA、充当支架来募集染色质修饰物来调节基因转录，从而在KD 的发病机制中发挥着重要作用[29]，因此具体IncRNA如何通过影响miRNA从而在KD 形成中发挥作用还值得进一步探索。综上，希望通过进一步研究miRNA 在KD中的表达以及作用特点，构建更为完善的调控网络，使我们对KD认识更全面，从而更有效地预防及治疗KD。