一起牛呼吸道疾病综合征的病原分析与药敏试验

钟舒红　吴翠兰　李军　李常挺　陶立　彭昊　潘艳　兰美益

摘要：为了解广西某牛场犊牛呼吸道疾病综合征的发病原因，本研究通过细菌分离与RT-PCR/PCR方法对该牛场病死牛肺脏进行病原分析，并对分离菌进行药敏试验。结果显示，该牛场发病牛呼吸道疾病综合征是由牛支原体、肺炎克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌和大肠杆菌混合感染引起。药敏试验结果显示，支原体分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、强力霉素等中度敏感;肺炎克雷伯氏菌分离株对头孢曲松、阿奇霉素等中度敏感;大肠杆菌分离株对壮观霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感;化脓隐秘杆菌分离株对头孢噻肟、氧氟沙星高度敏感，对壮观霉素、阿米卡星、泰乐菌素、阿奇霉素等中度敏感;4株分离菌均对所用青霉素类、磺胺类抗生素不敏感。临床治疗可以结合药敏试验结果选择喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类等3类抗生素联合用药。

关键词：牛呼吸道疾病综合征;牛支原体;肺炎克雷伯氏菌;化脓隐秘杆菌;大肠杆菌;混合感染;药敏试验;抗生素

中图分类号： S856.3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0168-04

收稿日期：2020-02-24

基金项目：广西科技重大专项（编号：桂科AA17204057）;贺州市科技项目（编号：贺科攻201808027）。

作者簡介：钟舒红（1986—），女，广西临桂人，硕士，助理研究员，主要从事动物疫病防治与病原学分子生物学研究。E-mail：zhongshuhong11@163.com。

通信作者：李 军，博士，副研究员，主要从事动物疫病防治与病原学分子生物学研究。E-mail：jlee9981@163.com。

牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是由宿主本身、病原体和环境因素（如早期断奶、长途运输、混群饲养、养殖密度大和通风不良）等综合因素相互作用引起的牛肺炎、支气管炎、运输热等疾病的通称，因其高发病率、高死亡率、造成巨大经济损失的特点，是一种全球范围内严重危害养牛业健康发展的疾病[1-2]。该疾病常发生于犊牛和新引进育肥牛群，并多发生于秋冬两季[3]。导致BRDC的细菌性病原体主要有多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、化脓隐秘杆菌（Pseudomonas pyogenes）、昏睡嗜血杆菌（Haemophilus lethargicus）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）等;病毒性病原体主要有牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza type 3 virus，BPIV3）等;牛支原体也可诱发牛呼吸系统疾病[4-8]。通常情况下，BRDC常由细菌、病毒和支原体混合感染引起，因而常需要借助实验室诊断才能确定BRDC病原体类型。

广西某牛场犊牛陆续出现精神沉郁、发烧、食欲减退并伴有咳喘、流涕等呼吸道症状。急性病例突然倒地，口鼻有白色泡沫流出，并迅速死亡。该牛场前后共有4头犊牛死亡，剖检见肺部表面有黄白色坏死灶、间质增宽并伴有不同程度的充血、实质性肉变;其他脏器无明显肉眼可见病变。本研究采集病死牛肺脏组织，运用细菌学、聚合酶链反应（PCR）、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等实验室方法来进行病原检测，并对分离菌进行药敏试验，以期为该病的临床防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料样品 广西某牛场病死牛肺脏组织。

1.1.2 主要试剂 马血清，购自北京索莱宝科技有限公司;PPLO营养肉汤，购自杭州百思生物技术有限公司;绵羊血琼脂营养平板、麦康凯琼脂平板，均购自北京陆桥技术有限责任公司;药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司;DNA/RNA抽提试剂盒、HiFi-Script cDNA合成试剂盒、DH5α感受态细胞、2×ES Taq MasterMix，均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱，购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司;显微镜，购自尼康映像仪器销售（中国）有限公司;PCR仪、凝胶成像系统，购自Bio-Rad公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 本研究所用引物序列全部参考吴翠兰等的研究[9]，并由广州华大基因科技有限公司合成。引物信息详情见表1。

1.2.2 病料样品的细菌及支原体分离鉴定 将采集的肺脏组织无菌划线接种于麦康凯琼脂平板和绵羊血琼脂营养平板，37 ℃恒温培养24～36 h，挑取单个菌落进行纯化培养，并进行革兰氏染色、镜检。并根据表1中的特异性引物和细菌16S rRNA通用引物进行PCR鉴定。牛支原体分离培养参照陶立等的研究[10]进行，并将疑似牛支原体株进行PCR鉴定。

1.2.3 病料样品的RT-PCR/PCR鉴定 严格按试剂盒说明书提取病料DNA、RNA，并将RNA反转录为cDNA。用针对牛支原体、肺炎克雷伯氏菌、化脓性隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌、BVDV、IBRV、BPIV3的引物分别进行PCR扩增。PCR扩增体系为25.0 μL：2×ES Taq MasterMix 12.5 μL，模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，退火40 s（退火温度详见表1），72 ℃延伸50 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增结束后，取7 μL PCR扩增产物进行1.5%凝胶琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。

1.2.4 药敏试验 用K-B纸片法进行分离菌的体外药敏试验，37 ℃恒温培养18～24 h（牛支原体为96 h），结果判断参照抗微生物药物敏感性试验执行标准美国临床与实驗室标准化协会（CLSI）M100-S21文件。

2 结果与分析

2.1 病料样品中细菌及支原体分离鉴定结果

在麦康凯琼脂平板上分离到2种菌落，一种为隆起、大而黏液样的淡粉红色菌落，另一种为表面平滑、湿润的粉色菌落;经革兰氏染色镜检2种菌落均为革兰氏阴性短杆菌;细菌16S rRNA PCR鉴定结果显示，黏液样的淡粉色菌落为肺炎克雷伯氏菌，另一种为大肠杆菌。绵羊血琼脂营养平板上分离到表面光滑、湿润、呈明显β溶血环的灰白色小菌落，经革兰氏染色镜检为革兰氏阳性杆菌，经细菌16S rRNA PCR鉴定结果为化脓隐秘杆菌。经过72 h 培养，PPLO支原体固体培养基上长出肉眼可见针尖大小的菌落，在显微镜下观察可见典型的煎蛋样菌落。

2.2 病料样品的RT-PCR/PCR鉴定结果

由图1可知样品PCR的检测结果。病死牛肺脏组织RT-PCR/PCR检测结果显示，牛支原体、肺炎克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌为阳性，BVDV、IBRV、BPIV3和多杀性巴氏杆菌为阴性。

2.3 分离菌及支原体的药敏试验结果

由表2可知，支原体分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、强力霉素等中度敏感，对环丙沙星、壮观霉素、阿米卡星、链霉素、泰乐菌素、阿奇霉素、青霉素G、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、复方新诺明等不敏感。肺炎克雷伯氏菌分离株对头孢曲松、阿奇霉素中度敏感，对头孢噻肟、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、壮观霉素、阿米卡星、链霉素、泰乐菌素、青霉素G、氨苄西林、复方新诺明、泰乐菌素、强力霉素等不敏感。大肠杆菌分离株对壮观霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感，对头孢曲松、头孢噻肟、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、泰乐菌素、青霉素G、氨苄西林、链霉素、复方新诺明、强力霉素等不敏感。化脓隐秘杆菌分离株对头孢噻肟、氧氟沙星高度敏感;对壮观霉素、阿米卡星、泰乐菌素、阿奇霉素中度敏感，对头孢曲松、恩诺沙星、环丙沙星、强力霉素、青霉素G、氨苄西林、链霉素、复方新诺明等不敏感。

3 讨论

牛呼吸道疾病综合征（BRDC）是由牛支原体、细菌和病毒单独或混合感染导致的牛肺炎、支气管炎等疾病的统称。其临床症状主要表现为高热（体温为40.0～41.5 ℃）、精神沉郁、食欲下降、呼吸困难、咳嗽、流涎、眼分泌物增多等。其中，有些病毒单独感染牛后常为隐性感染，临床症状不明显，但当这些牛只受到应激时，机体的抵抗力下降，就会引起继发性感染，从而导致牛只的发病率和死亡率增加[11-12]。在国外与牛支原体混合感染的病原微生物有很多，如溶血性曼氏杆菌、IBRV、BRSV、BPIV3等[13]。国内张晓宇研究显示，我国牛呼吸道疾病综合征病原体中牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、IBRV、BVDV、BPIV3的阳性分离率分别为47.5%、0.7%、0.5%、22.0%、28.0%、12.0%[14]。吴翠兰等报道显示，广西牛呼吸道疾病综合征病原体中牛支原体、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、IBRV的阳性分离率分别为28.2%、41.0%、33.3%、20.5%、15.4%、5.1%、12.8%[9]。本研究结果显示，该牛场犊牛呼吸道疾病综合征为牛支原体、肺炎克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌和大肠杆菌混合感染。傅欣玲等报道，江苏某牛场肉牛呼吸道疾病为BVDV、BPIV3和大肠杆菌混合感染[15];赵文苹等报道，黑龙江1例牛呼吸道疾病为巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染[16]。综上，不同地区引起BRDC的病原体不同，这可能是由于各地区气候环境不同从而影响各病原体在各地区的流行情况，我国南方较北方潮湿多雨，气温较高，更适合细菌的繁殖与生长。

本研究药敏试验结果显示，支原体分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、强力霉素等中度敏感，对环丙沙星、壮观霉素、阿米卡星、链霉素、泰乐菌素、阿奇霉素、青霉素G、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、复方新诺明等不敏感。肺炎克雷伯氏菌分离株对头孢曲松、阿奇霉素中度敏感，对头孢噻肟、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、壮观霉素、阿米卡星、链霉素、泰乐菌素、青霉素G、氨苄西林、复方新诺明、泰乐菌素、强力霉素等不敏感。大肠杆菌分离株对壮观霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感，对头孢曲松、头孢噻肟、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、泰乐菌素、青霉素G、氨苄西林、链霉素、复方新诺明、强力霉素等不敏感。化脓隐秘杆菌分离株对头孢噻肟、氧氟沙星高度敏感;对壮观霉素、阿米卡星、泰乐菌素、阿奇霉素中度敏感，对头孢曲松、恩诺沙星、环丙沙星、强力霉素、青霉素G、氨苄西林、链霉素、复方新诺明等不敏感。以上结果表明，4株分离菌均对所用青霉素类、磺胺类抗生素不敏感;对喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类所用抗生素较敏感，临床治疗可以根据药敏试验结果选择以上3类抗生素联合用药。

由于牛呼吸道疾病的病原体多样，目前市面上缺少有效疫苗，迄今为止牛的呼吸道疾病主要靠药物治疗。但是随着抗生素在畜禽生产养殖过程中的普遍使用，细菌的耐药性问题日益严重[17]，因此建立快速的抗生素耐药检测体系、强化兽医人员和养殖户对细菌耐药性的认识、防止产生新的耐药菌株、阻止已存在的耐药性传播以及研发和筛选新的抗菌药物等迫在眉睫[18]。

牛呼吸道疾病对我国养牛业影响巨大，然而国内对牛呼吸道疾病的防治研究相对滞后，我们须要根据国内的实际情况，借鉴国外的防控经验，制定合理的防控策略;同时研究有效的防治疫苗和药物是今后研究的主要方向，以期开发有效疫苗和诊断制剂，保障我国养牛业的健康发展[15]。

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