生防芽孢杆菌S12产芽孢摇瓶发酵条件优化

李全胜　武冬梅　陈云　王国栋　梁飞

摘要：通过优化生防芽孢杆菌S12产芽孢发酵条件，以提高其摇瓶水平上发酵液中芽孢产量，为其进一步产业化开发提供技术支撑。在摇瓶水平上，首先采用单因素试验研究不同的发酵时间、初始pH值、温度、转速、接种量和装液量等发酵条件对生防芽孢杆菌S12芽孢数量、菌体数量和产率的影响，随后采用正交试验优化确定各发酵条件的最佳组合。生防芽孢杆菌S12产芽孢的最适发酵条件为：装液量80 mL/250 mL、接种量3%、初始pH值7.0、温度35 ℃、转速160 r/min、时间84 h。发酵条件优化后，摇瓶水平上S12菌株的芽孢数量、菌体数量分别达到5.721×109、5.822×109 CFU/mL，芽孢產率为98.28%。正交试验优化后的发酵条件提高了S12菌株的芽孢产量，降低了生产成本，为其进一步生防菌剂的生产和应用奠定了基础。

关键词：生防芽孢杆菌;芽孢产量;发酵条件;正交试验

中图分类号： S435.621;S182  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0119-06

收稿日期：2019-11-21

基金项目：新疆生产建设兵团科技攻关与成果转化计划（编号：2016AD029、2016AC008）;新疆生产建设兵团中青年领军人才计划（编号：2018CB026）;国家重点研发计划（编号：2016YFD02004005-4、2017YFD0201506）。

作者简介：李全胜（1986—），男，山东齐河人，硕士，助理研究员，主要从事土壤微生物发掘及利用研究。E-mail：moucheng2005@126.com。

通信作者：梁 飞，博士，副研究员，主要从事土壤肥料与滴灌技术研究。E-mail：liangfei3326@126.com。

我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的一种毁灭性种传和土传性病害，俗称“棉花癌症”[1-2]。大丽轮枝菌寄主广泛，达600多种，主要是锦葵科、豆科、十字花科和茄科等双子叶植物，且易受环境和寄主变化的影响而产生新的生理型，并且形成的微菌核在土壤中存活时间达十几年，给防治工作造成了巨大的困难[3-4]。目前，国内外对棉花黄萎病的防治主要采用轮作倒茬、选育抗病品种、化学防治和生物防治等手段，其中生物防治具有环境友好、绿色环保、不易产生抗性、发展潜力大等优势而备受大家关注和青睐[5]。

芽孢杆菌不仅能产生抗菌物质，且可形成抗逆性的芽孢，便于运输和储藏，是一种理想的生防微生物[6-7]。目前应用的农业生防制剂多采用芽孢杆菌作为菌种资源，制剂中芽孢的含量是影响制剂应用效果的关键因素[8-9]，因此在芽孢杆菌菌株进行工业化生产前，须要通过发酵工艺优化提高发酵液中芽孢的产量。从不同生境中筛选分离的芽孢杆菌菌株对营养及生长条件要求不同，优化适合特定生境菌株的发酵条件是菌剂工业化生产的基础。不同学者利用单因素、正交设计和响应面分析方法优化芽孢杆菌的发酵工艺，提高芽孢产量。侯敏等采用单因素和正交试验对芽孢杆菌S13产芽孢培养条件进行优化，芽孢数量达到4.9×109 CFU/mL，芽孢产率达到90%[10];卢彩鸽等利用响应面分析方法对芽孢杆菌MH71的产芽孢培养条件进行优化，优化后芽孢数量达到1.2×109 CFU/mL[11]。发酵条件优化不仅能够提高芽孢产率，而且能降低生产能耗，提高经济效益。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S12是从新疆绿洲棉田中分离获得的1株广谱抗真菌生防菌株，尤其对大丽轮枝菌具有较强的拮抗作用[12]，具备微生物菌剂商业化开发的潜力。芽孢含量是影响微生物杀菌剂贮藏运输和防治效果的关键因素[13-14]。本研究团队前期采用响应面分析法优化确定了菌株S12产芽孢培养基的优化配比组合[15]，为了进一步提高发酵液中菌株S12的芽孢产量，本试验在优化培养基的基础上采用单因素和正交设计试验对芽孢杆菌S12产芽孢发酵条件进行优化，以期为该菌株的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 生防芽孢杆菌S12分离自新疆连作棉田根际土壤，4 ℃试管斜面保存。

1.1.2 培养基 NA培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉15 g/L，pH值7.0～7.2;NB培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0-7.2;发酵培养基：玉米粉13 g/L，大豆蛋白胨15.1 g/L，CaCO3 0.7 g/L，NaH2PO4·2H2O 2 g/L，Na2HPO4·2H2O 4 g/L，pH值7.0～7.2[14]。

1.2 种子液的制备

1.2.1 菌株活化及培养 将保存的菌株S12接种于NA培养基平板上，30 ℃培养16 h。

1.2.2 种子发酵 将活化的菌株S12接种到装有40 mL NB培养基的100 mL三角瓶中，于摇床30 ℃、180 r/min振荡培养14 h作为种子液。

1.3 单因素试验

将培养14 h的种子液接入配制的发酵培养基中，接种量为1%，250 mL的三角瓶装液量为60 mL，pH值7.0，150 r/min、30 ℃振荡培养84 h进行发酵，为了进行单因素试验筛选，依次对以上发酵条件中的发酵时间、初始pH值、温度、转速接种量、装液量进行改变，其中分别设定发酵时间为36、48、60、72、84、96 h，初始pH值为5、6、7、8、9、10，温度为20、25、30、35、40 ℃;转速为120、140、160、180、200 r/min，接种量为1%、3%、5%、7%、9%，250 mL三角瓶装液量为40、60、80、100、120 mL，考察各因素对芽孢数量、菌体数量和芽孢产率的影响，从而确定正交试验的因素及水平。

1.4 正交设计试验

根据单因素试验结果，确定对菌株S12芽孢产量影响因素的考察水平，按照正交试验表L18（36）设计6因素3水平的正交试验，比较装液量、温度、转速、发酵时间、接种量不同水平组合对S12菌株芽孢数量、菌体数量和芽孢产率的影响。

1.5 测定项目及方法

采用系列稀释平板涂布法进行菌体和芽孢计数，其中芽孢计数前将发酵菌液经过80 ℃水浴15 min后进行。芽孢产率=芽孢数量/菌体数量×100%。试验于2018年在新疆农垦科学院作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室进行。

1.6 数据处理分析

采用Excel2007软件进行数据统计，运用GraphPad Prism 5.0软件作图，采用SPSS 17.0软件进行正交试验设计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 发酵条件单因素试验

2.1.1 发酵时间

随着发酵时间的延长，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现逐渐增多的趋势（图1-A），分别由36 h的0.028×109、0.155×109 CFU/mL增加到96 h的2.230×109、2.330×109 CFU/mL;当发酵时间延长到84 h时，芽孢数量和菌体数量均达到最大值，分别为2.240×109、2.350×109 CFU/mL;此时芽孢产率也达到最大值95.32%，因此选择72、84、96 h作为正交试验的发酵时间的3个水平。

2.1.2 初始pH值

随着发酵液初始pH值的升高，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现先增加后降低的趋势（图1-B），pH值为7时均达到最大值，分别为2.212×109、2.292×109 CFU/mL，此时芽孢产率也达到最大值96.42%。从图1-B可以看出，发酵滤液呈酸性或碱性，对芽孢的形成和菌体生长均影响较大，因此选择pH值为7作为正交试验发酵培养基的初始pH值。

2.1.3 温度

随着发酵温度的升高，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现先增加后降低的趋势（图1-C），发酵温度为35 ℃时均达到最大值，分别为3.675×109、3.766×109 CFU/mL，此时芽孢产率也达到最大值97.60%。当温度低于或高于35 ℃时，发酵液中的芽孢数量和菌体数量均有所下降，因此，选择30、35、40 ℃作为正交试验的发酵温度的3个水平。

2.1.4 转速

随着转速的增加，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现先增加后降低的趋势（图1-D），转速为180 r/min时均达到最大值，分别为3.590×109、3.930×109 CFU/mL，此时芽孢产率也达到最大值91.38%。当转速高于或是低于180  r/min 时，发酵液中的芽孢数量和菌体数量均有所下降，因此选择160、180、200  r/min作为正交试验的转速的3个水平。

2.1.5 接种量

随着接种量的增加，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现先增加后降低的趋势（图1-E），但趋势变化不大，接种量为5%时均达到最大值，分别为3.255×109、3.375×109 CFU/mL，此时芽孢产率也达到最大值96.46%。当接种量高于或是低于5%时，发酵液中的芽孢数量和菌体数量均有所下降，因此选择3%、5%、7%作为正交试验的转速的3个水平。

2.1.6 装液量

随着装液量的增加，发酵液中芽孢数量和菌体数量均呈现先增加后降低的趋势（图1-F），装液量为80 mL/250 mL时均达到最大值，分别为3.675×109 CFU/mL、3.766×109 CFU/mL，此时芽孢产率也达到最大值97.53%。当接种量高于或是低于80 mL/250 mL时，发酵液中的芽孢数量和菌体数量均有所下降，因此选择60、80、100 mL/250 mL 作为正交试验的转速的3个水平。

2.2 发酵条件正交试验优化

单因素的试验结果表明，发酵条件不同因素对菌株S12芽孢数量和菌体数量都有影响，为综合评价各发酵因子对S12菌株芽孢数量和菌体数量，采用L18（36）正交表，设计6因素3水平正交试验，以进一步确定影响S12菌株发酵产芽孢各发酵因子的最佳组合。

从表1可以看出，产芽孢发酵各条件最佳组合为A2B2C2E3F3，即产芽孢最佳发酵条件为装液量80 mL/250 mL、温度35 ℃、转速180 r/min、时间96 h、接种量7%，5个因素的主次顺序依次为A（装液量）>B（温度）>E（时间）>C（转速）>F（接种量）。产菌体各发酵条件最佳组合为A2B2C2E3F3，即产芽孢最佳发酵条件为装液量80 mL/250 mL、温度35 ℃、转速180 r/min、时间96 h、接种量7%，5个因素的主次顺序依次为A（装液量）>E（时间）>B（温度）>C（转速）≈F（接種量）。芽孢产率各发酵条件最佳组合为A2B2C2E2F3，即产芽孢最佳发酵条件为装液量80 mL/250 mL、温度35 ℃、转速180 r/min、时间84 h、接种量7%，5个因素的主次顺序依次为A（装液量）>B（温度）>E（时间）>C（转速）>F（接种量）。极差评价分析结果显示，装液量是影响发酵条件的主要因素，其次是温度和时间，最后是转速和接种量。

发酵条件优化的方差评价结果见表2、表3、表4。其中，产芽孢发酵条件中，因素A和B的P值均小于0.05，即这2种因素对产芽孢数量试验结果影响显著;因素C、E和F的P值均大于0.10，即因素C、E和F对试验结果影响不显著;各因素主次顺序为A（装液量）>B（温度）>C（转速）>E（时间）>F（接种量）（表2）。产菌体发酵条件中，因素A的P值小于0.05，即该因素对产菌体数量试验结果影响显著;因素B和E的P值均小于0.10，即因素B、E对试验结果有一定的影响;而C和F的P值均大于0.10，即因素C和F对试验结果影响不显著;各因素的主次顺序为A（装液量）>E（时间）>B（温度）>C（转速）>F（接种量）（表3）。芽孢产率发酵条件中，因素A的P值小于0.05，即该因素对产菌体数量试验结果影响显著;因素B的P值小于0.10，即因素B对试验结果有一定影响;而C、E和F的P值均大于0.10，即因素C、E和F对试验结果影响不显著;各因素影响试验结果的主次顺序为A（装液量）>B（温度）>E（时间）>C（转速）>F（接种量）（表4）。方差评价结果显示，装液量是对试验结果显著影响的因素，温度和时间是有一定影响的因素，而转速和接种量是影响不显著的因素，与极差评价结果基本一致。

根据方差分析法的结果，只须对试验结果有显著影响的因素选取最佳水平，而影响较小的因素则可按实际需要和投入产出效益选择适当的水平[16]。本试验发酵条件各因素的较佳组合为A2B2C1E2F1，即菌株S12产芽孢摇瓶培养较佳发酵条件为装液量80 mL/250 mL、温度35 ℃、转速160 r/min、时间84 h、接种量3%。

2.3 验证试验

发酵条件优化后的组合为：装液量80 mL/250 mL、接种量3%、初始pH值7.0、温度35 ℃、转速160 r/min、时间84 h，此条件下芽孢产量为5.721×109 CFU/mL，活菌数为5.822×109 CFU/mL，比优化前（芽孢为2.240×109 CFU/mL，菌体为2.350×109 CFU/mL）分别增加2.55、2.48倍，此时发酵液中芽孢产率为98.28%。

3 讨论与结论

随着我国经济的快速发展、居民生活水平的不断提高，消费者对农产品的质量安全要求也越来越高。绿色有机生态农业备受人们重视。在生态农业病虫害防治方面，环保无毒害作用的生防菌剂逐渐发挥作用并且替代了部分化学农药，其生产量和需求量日益增高[17-18]。作为生防菌剂菌种资源的芽孢杆菌，由于具有来源广泛、繁殖力强、对人畜无害、不污染环境等特点，成为近年来研究和应用的热点[6]。芽孢杆菌不仅能产生多种脂肽类抑菌物质，抑制真菌病原菌的生长，还具有诱导作物产生抗病性的作用，并且可形成抗逆性的芽孢，便于运输和储藏，是一种理想的商业化生防微生物。

正交试验设计是研究多因素、多水平一种设计方法，具有高效、快速、经济的优势[16]。蒋盼盼等采用正交试验设计对解淀粉芽孢杆菌B1619发酵工艺进行了优化，优化后发酵菌液含菌量同初始发酵工艺相比提高87.83%[16]。成莉凤等采用正交试验设计研究枯草芽孢杆菌BE-91生长及其胞外表达β-甘露聚糖酶的发酵条件的优化组合，优化条件下发酵10 h，β-甘露聚糖酶活性最高达432.4 IU/mL，即缩短了发酵时间也提高了酶活性[19]。发酵工艺参数的优化是微生物发酵产品成功实现产业化的重要环节。枯草芽孢杆菌S12产芽孢发酵工艺涉及的因素较多，无法逐一地进行研究，因此根据细菌发酵工艺参数，首先进行单因素试验筛选，然后再根据筛选结果设计正交试验对枯草芽孢杆菌S12产芽孢摇瓶发酵条件进行优化，以期获得菌株S12产芽孢的最佳发酵条件参数，提高其发酵液中的芽孢含量，降低投入成本，为微生物菌剂的工业化生产提供理论依据。

试验结果表明，单因素试验筛选和正交试验设计结合是一种较好的设计组合，能在较短的时间内确定发酵工艺的关键参数[16]。验证试验结果表明，优化后获得的枯草芽孢杆菌S12产芽孢的发酵条件为：装液量80 mL/250 mL、接种量3%、初始pH值7.0、温度35 ℃、转速160 r/min、时间84 h。该研究结果不仅提高了发酵液中芽孢的数量和产率，并为枯草芽孢杆菌S12进一步产业化的开发节约了生产成本。但本试验对枯草芽孢杆菌S12发酵条件优化仅进行了摇瓶发酵的初步研究，以上参数有待于在后续工厂化生产中进一步验证，从而为该菌株用于生防菌剂的研制提供理论依据

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