培养基及接种材料对走马胎瓶苗生根和移栽的影响

唐凤鸾　郭丽君　赵健　毛世忠

摘要：以走马胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）健壮瓶苗为试验材料，通过正交设计研究了不同基本培养基、不同浓度IAA和NAA及培养材料类型对走马胎组培苗生根培养及移栽的影响。结果表明：（1）在生根培养中起主导作用的因素是基本培养基，在生根苗移栽中起主导作用的因素是培养材料类型和基本培养基;（2）生根率受影响最大，其次为根长，主根数最小;（3）走马胎生根培养最佳组合为1/2 MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+顶芽;（4）带叶茎段可用作走马胎组培苗生根培养材料，生根率达88.95%，这与传统木本植物组织培养生根材料使用顶芽不同，具有一定创新性。本研究技术能有效提高培养材料使用率，减少药品用量，降低生产成本，可用于走马胎种苗规模化生产。

关键词：走马胎;规模生产;生根;材料类型;正交试验

中图分类号： S567.1+90.43  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0030-05

收稿日期：2019-12-20

基金项目：广西科技计划 （编号：桂科AB16380212）。

作者简介：唐凤鸾（1978—），女，广西桂林人，副研究员，主要从事生物技术与珍稀濒危植物保育研究。E-mail：tfl7288@163.com。

通信作者：赵 健，副研究员，主要从事栽培与生物技术研究。E-mail：358788030@qq.com。

走马胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）属紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛属（Ardisia）常绿灌木，是我国西南地区少数民族常用药材，主治跌打损伤、风湿疼痛等，民间常有“两脚行不开，不离走马胎”之说。近年来，随着人们对植物化学和药理作用研究的深入，走马胎的新功能不断被发现，如三萜皂苷类成分对HeLa、MCF-7、BCG-823、EJ、Hepg2 等多种肿瘤细胞有明显抑制作用[1-4]，岩白菜素类衍生物能清除逆境产生的自由基，具有较强的抗氧化能力[5]，因此走马胎越来越受到人们的重视。

走马胎种子稀少，茎干分枝能力非常弱，利用传统的播种和扦插方法繁殖种苗难以满足生产需求。目前有关走马胎组织培养的研究已有报道[6-8]，在生根培养阶段，王强等均以不定芽单株为材料，MS为基本培养基获得生根植株[7-8];而唐凤鸾等发现，走马胎带叶茎段在以1/2MS为基本培养基的培养配方上也能获得较好的培养效果[6];然而在木本植物组织培养中普遍认为，低浓度的无机盐更容易诱导其产生不定根[9-10]，并能减少药品用量，降低生产成本。笔者在试验中发现，利用腋芽繁殖的走马胎种苗叶片宽厚，茎干粗壮，质量好，但由于该物种的顶端优势非常强，即使在组织培养中也基本只有1个侧芽萌发，极少出现2个或以上芽生长，这对木本植物以带叶顶芽为培养材料进行生根诱导的传统方法非常不利，严重降低了材料的使用效率，不利于生产成本的控制;同时发现，不同方法培养的走马胎组培苗对移栽管护技术要求不同，部分方法虽然能获得较好的生根率，但植株叶片质地薄，角质化程度低，极易失水萎蔫，非常不利于移栽，成活率也得不到保障。因此，为了明确培养基成分和各类培养材料对走马胎瓶苗生根及移栽的影响，提高种苗生产效率并控制成本，本试验研究不同基本培养基、培养材料类型及植物生长调节剂对走马胎组培苗生根培养的影响，以期为走马胎组培种苗的生产提供更实用的技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于走马胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）生根培养的材料是由广西桂林周边地区的野生走马胎植株的幼嫩枝条经过启动、增殖培养获得的，为高度达6.0 cm以上的健壮瓶苗。

1.2 试验方法

试验于2019年1—12月分别在广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所生物技术中心组培实验室及育苗大棚内进行。

1.2.1 不同因素对瓶苗生根培养的影响试验

在前期走马胎组织培养试验的基础上，选取叶片硕大、茎干粗壮、色泽纯正的走马胎组培苗，将其分别剪成带2张半张叶的顶芽、带2张半张叶的茎段和无叶茎段3类材料，茎长均达2.0 cm以上;将3类材料分别接种于含不同基本培养基、不同浓度生长素（IAA）和萘乙酸（NAA）的生根培养基中，采用4因素3水平L9（34）正交设计进行试验（表1）。试验共设9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接种15个材料，重复3次。

1.2.2 生根培养试验结果验证

對正交试验结果进行统计分析，总结出优选培养方案，并通过验证试验及扩大生产对优选方案进行可靠性检验。验证试验每个处理接种20瓶，每瓶接种15个材料，重复3次;扩大生产每个处理至少接种1 000瓶，随机统计100瓶。

向培养基中另加30 g/L蔗糖和 6.0 g/L 琼脂，调节pH值为5.5～6.0。分装后于124 ℃下消毒 22 min。培养室采用日光灯为光源，光照度为40～60 μmol/（m2·s），照射时间为 12 h/d;培养温度为（25±2） ℃。

1.2.3 不同条件下培养的生根苗移栽试验

将通过正交试验获得的生根瓶苗从培养室移到大棚，炼苗7～10 d后取出，清洗干净培养基，并用甲基托布津50倍液浸泡1～2 min，再移栽于园土、泥炭、珍珠岩体积比为3 ∶1 ∶1的混合基质中，在85%荫蔽度的大棚中培养。

1.3 统计分析

观测记录接种50 d后走马胎瓶苗的生根率、主根数、平均根长、侧根和茎叶生长情况及生根苗移栽50 d后的成活率。生根率=生根苗数/接种苗总数×100%，主根数为从苗茎基部长出的根数，平均根长=主根总长度/总根数，移栽成活率=移栽后成活苗数/移栽总苗数×100%。试验数据采用Excel、SPSS 16.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素对走马胎瓶苗生根培养的影响

将生根材料接入培养基约1周后茎段基部膨大，2周后可见白色粗壮的不定根形成，此时腋芽开始萌动生长，40 d后形成完整植株。培养50 d后的观测结果（表2）表明，各因素对走马胎组培苗生根培养中根系诱导和茎叶生长的影响差异较大。1号处理至6号处理生根率高、主根数量多、侧根发达、根系生长均匀，且茎叶生长良好，色泽纯正（图1）;9号处理虽然植株生根率达97.78%，但根数少，根系弱，茎干细;7号处理和8号处理不仅生根率低，分别只有68.52%和58.89%，而且根茎叶整体生长效果差。

2.2 不同条件下走马胎组培苗生根培养的统计分析

对观测结果进行极差分析可知（表3），各因素对走马胎组培苗生根培养中生根率的影响大小顺序为基本培养基>培养材料类型>NAA>IAA，对主根数量的影响大小顺序为基本培养基> IAA>NAA >培养材料类型，对平均根长的影响大小顺序为基本培养基>NAA>IAA>培养材料类型;其中基本培养基对走马胎组培苗生根培养的影响最大，IAA、NAA、培养材料类型3个因素对生根率和主根数量的影响接近。进一步进行方差分析，结果显示，4个测试因素对生根率的影响均达到极显著水平（P<0.01，F0.01=8.02），基本培养基和NAA对平均根长的影响达到极显著水平（P<0.01，F0.01=8.02），仅基本培养基对主根数量的影响达到极显著水平（P<0.01，F0.01=8.02）。由此可见，基本培养基类型在走马胎组培苗生根培养中起主导作用。

对各因素不同水平培养条件下的植株生根率、平均主根数量和根长进行多重比较分析，结果（表3）发现，使用不同基本培养基培养的效果差异显著（P<0.05），当基本培养基为1/2MS时有利用走马胎组培苗生根培养，其生根率、主根数量和平均根长均最大;其次为MS，除主根数量与1/2MS差异显著外（P<0.05），其他培养效果与1/2MS接近;1/2MS+5 mg/L 维生素B2培养效果最差，对应生根率、主根数量和平均根长分别只有75.06%、1.21条和2.67 cm。不同浓度NAA对生根率和平均根长的培养效果差异显著（P<0.05），当NAA浓度为10 mg/L时有利于走马胎组培苗根系诱导及伸长，生根率和平均根长分别为98.70%、4.29 cm，其次为1.5 mg/L;不同浓度IAA和培养材料类型对生根率的影响差异也達显著水平（P<005），其中 2.0 mg/L IAA和顶芽的培养效果最好，生根率分别为98.52%、98.86%;IAA、NAA和培养材料类型对走马胎组培苗主根数量的影响差异不明显。

从分析结果可以看出，根据走马胎组培苗生根培养中生根率、平均根长各因素的最佳水平为 1/2MS、2.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、顶芽，根据主根数量各因素的最佳水平为1/2MS、1.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、带叶茎段。但在植物组织培养中，当组培苗根系生长正常时，其生根培养的主要考核指标为生根率和根条数，又因2.0 mg/L IAA、顶芽与1.0 mg/L IAA、带叶茎段对生根率影响差异显著（P<005），而对平均主根数量效果差异不明显（P>005），故综合考虑植株根系及茎叶生长情况、主效因素等认为，1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+顶芽为走马胎组培苗生根培养的最佳组合;带叶茎段的生根率和主根数量分别达88.95%和3.20条，均处于较好水平，也可用作走马胎组培苗生根培养。

2.3 验证试验及扩大生产结果

在正交试验基础上，对1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+顶芽的生根组合（组合1）及以1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA为生根培养基接种带叶茎段（组合2）的实际培养效果进行验证。结果在验证试验中，组合1的生根率为10000%、主根数量为4.95条，组合2的生根率为92.80%、主根数量为4.24条;在扩大生产中，组合1的生根率为95.6%、主根数量为4.18条，组合2的生根率为89.67%、主根数量为4.35条。可见以1/2MS+2.0 mg/LIAA+1.0 mg/L NAA为生根培养基时，顶芽和带叶茎段均可用于走马胎组培苗生根培养。

2.4 不同因素对走马胎生根苗移栽的影响

由表2可知，不同因素组合处理培养的走马胎生根苗在移栽环节成活率差异较大，其中7号处理移栽成活率为100%，1、5、6、9号等4个处理的成活率均达95%及以上，2号和3号处理成活率较低，分别仅为66.43%和43.97%。极差和方差分析结果表明，各因素对走马胎组培生根苗移栽成活率的影响大小顺序为培养材料类型>基本培养基> IAA>NAA，且材料类型和基本培养基的影响达显著水平（P<0.05）（表4）。对各因素中不同水平间的成活率进行多重比较分析（表4），发现在不同的基本培养基、培养材料类型和IAA浓度下差异显著（P<005），其中MS、1/2MS、顶芽、带叶茎段及1.0 mg/L IAA的效果较好。这与生根培养和验证试验结果相呼应，进一步说明试验结果具有可靠性。

3 结论与讨论

从观测结果看，不同培养材料类型对走马胎组培苗生根培养的外观生长影响差异较明显，其中以顶芽和带叶茎段为材料培养形成的生根植株叶片宽厚、健壮，且数量较多;以无叶茎段培养的生根植株不仅叶片质地薄、叶面积小，而且数量也少。经统计分析后发现，培养材料类型可极显著影响走马胎组培苗的生根率（P<0.01，F0.01=8.02），生根率大小表现为顶芽>带叶茎段>无叶茎段，但对主根数量和平均根长的影响差异不明显。鉴于顶芽和带叶茎段对走马胎组培苗生根培养的整体影响，而且带叶茎段的生根率也可达88.95%，因此在实际生产中可将较高的不定芽剪成符合要求的顶芽和带叶茎段进行生根培养，从而提高材料的利用率。