新型猪α干扰素YNS突变体的构建及其抗病毒活性检测

王朋涛，梁秀丽，徐盟龙，赵福杰，闫晓光，魏战勇, 3*

(1. 河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2. 安阳工学院，河南 安阳 455000；3. 河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖等多功能糖蛋白，在适应性免疫调节中起着重要作用[1]。干扰素在病原入侵机体时诱导相关抗病毒蛋白的表达，例如：蛋白激酶R、干扰素诱导黏病毒抵抗蛋白等[2-4]，使机体处于抗病毒状态。干扰素广泛用于养殖业，在蓝耳病、口蹄病等病毒性疾病治疗中效果显著[5-6]。

猪α干扰素基因编码166个氨基酸，其空间结构主要由5个α螺旋组成，无内含子，有至少17个亚型[7-8]。猪α干扰素在机体内分布广泛，但表达量较低，无法满足生产需要[9]。因此许多学者利用基因工程对猪α干扰素进行研究。Lefevre等[10]对猪α干扰素进行体外克隆、基因序列分析和少量表达。陈涛等[11]改变猪α干扰素第86 位氨基酸, 并对其密码子进行优化，获得蛋白活性为52 000 IU/mg的突变体。李爽等[12]改变猪α干扰素不同的氨基酸活性位点，获得了蛋白活性为2.97× 108IU/mg的突变体。本研究将天然猪α干扰素的第58位组氨酸H、59位谷氨酸E及61位亮氨酸L分别突变为酪氨酸Y、天冬氨酸N及丝氨酸S，成功构建了猪α干扰素YNS突变体，运用大肠杆菌系统表达纯化后，其抗病毒活性与天然猪α干扰素相比明显提高，为干扰素的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

含有猪α干扰素基因的重组质粒、原核表达载体pET-32a、大肠杆菌感受态细胞DH-5α和Rosetta(DE3)由河南省动物性食品安全重点实验室保存。

1.2 细胞与病毒

Vero细胞和水泡性口炎病毒(VSV-Indiana)由中科院武汉病毒研究所惠赠。

1.3 主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自北京宝日医生物技术有限公司，猪α干扰素单克隆抗体(G16，Santa Cruz)购自北京百奥曼科技有限公司，羊抗鼠IgG(HRP标记)购自武汉三鹰生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.4 引物设计及合成

根据猪α干扰素基因(登陆号：AB369102.1)设计两对引物, 其中F1和R1用于扩增完整的猪α干扰素基因并包含BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位点，W1和W2反向互补且包含突变位点(表1)。引物由郑州尚亚生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 猪α干扰素YNS突变体基因的扩增

以猪α干扰素基因重组质粒为模板，利用F-1、W-1和W-2、R-1两对引物进行PCR扩增，扩增片段命名为P1和P2。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环。反应结束后，以F-1、R-1为引物，以P1、P2为模板进行扩增，扩增程序如上。反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.6 重组表达载体pET-32a-IFN-α的构建

用BamHⅠ、XhoⅠ分别对PCR产物和表达质粒进行双酶切，16 ℃连接。转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并送至武汉奥科生物有限公司进行序列测定。

1.7 重组质粒pET-32a-IFN-α的表达及鉴定

将鉴定正确的阳性质粒转至表达菌Rosetta中，挑选阳性克隆，37 ℃、200 r/min 振荡扩大培养至OD值为0.6～0.8，加入IPTG(1 mmol/L)诱导8 h。收集菌体进行超声波裂解，4℃、12 000 r/min离心，取沉淀和上清进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定。

1.8 表达产物的纯化

经超声波破碎后，4 ℃、12 000 r/min离心，4 mol/L尿素(无菌PBS配制)洗涤沉淀3次以除去杂蛋白，4 ℃、12 000 r/min离心。取适量的6 mol/L尿素溶解沉淀，分别用5、4、3、2、1 mol/L尿素溶液依次透析，每个阶段6 h，最后用无菌的PBS(pH 7.2)透析24 h。测定蛋白含量，-80 ℃保存。

1.9 蛋白内毒素测定

利用ToxinSensorTM内毒素检测试剂盒(L00350)检测纯化后干扰素内毒素的含量，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.10 干扰素的生物活性测定

VSV的半数细胞感染量(TCID50)测定：将Vero细胞接种到96孔板中， 24 h后每孔加入10倍倍比稀释的VSV病毒100 μL，每个稀释度设6个重复孔。继续培养72 h，按Reed-Muench法计算TCID50。

MTT法检测干扰素在Vero细胞上的安全浓度：利用MTT试剂盒(索莱宝M1020-500T)检测，酶联免疫检测仪在OD490nm处测量生物活性。

抗病毒活性的测定：采用细胞病变(CPE)抑制法在Vero-VSV系统上测定猪α干扰素突变体蛋白的抗病毒活性。同时对VSV的TCID50和基因拷贝数进行检测。将Vero细胞接种到6孔板中，24 h后每孔加入浓度分别为100 ng/mL和1 ng/mL的干扰素100 μL，同时设置对照组。继续培养24 h，试验组每孔接入100 TCID50/0.1 mL VSV。培养至病毒对照组有75%细胞出现病变时，分别收取上清和细胞检测。VSV(Real-time pCR)检测方法及其标准曲线参照文献[13]方法建立。引物序列如表1。

1.11 统计分析

采用Prism 6.0进行的统计分析，每个数据重复3次，试验数据是用平均值显示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 猪α干扰素突变体的克隆

猪α干扰素突变体基因扩增产物，核酸电泳和测序显示，扩增片段大小符合预期，长 501 bp并含有3个预期突变位点，与参照序列同源性97.6%。双酶切鉴定结果显示成功构建猪α干扰素突变体表达质粒(如图2)。

M. DL 2000 DNA Marker；1. 片段P1; 2. 片段P2; 3. 猪α干扰素；N. 阴性对照

M. DL 5000 DNA Marker；1. pET-32a--IFN-α双酶切产物; 2. pET-32a 双酶切产物; 3. 猪α干扰素

2.2 重组蛋白的表达及鉴定

将重组质粒转入Rosetta(DE3)诱导表达，超声破碎后，SDS-PAGE检测(如图3)结果显示，蛋白分子量约33 kDa，符合预测结果，蛋白表达形式为包涵体。电泳结束后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，与猪α干扰素单克隆抗体和羊抗鼠HRP抗体反应，结果显示在33 kDa处显示一条清晰的特异性条带，与目的蛋白相对分子质量一致(如图4)。

2.3 内毒素检测

利用内毒素检测试剂盒，检测纯化后干扰素蛋白内毒素的含量。检测结果显示，猪α干扰素突变体和参考蛋白的内毒素(0.8 mg/mL)的检测平均值分别为0.59 EU/mL和0.62 EU/mL，符合2015版《中国药典》中通则1143要求(如图5)。

M. 蛋白Marker；1. Rosetta；2. pET-32a空载体诱导；3.重组质粒pET-32a--IFN-α诱导；4. 沉淀中的重组蛋白；5. 上清中的重组蛋白

M. 蛋白Marker；1. 重组质粒pET-32a-IFN-α诱导；2. pET-32a空载体诱导

注：Y表示参照序列蛋白，YNS 表示猪α干扰素YNS突变体。下同

2.4 蛋白生物活性测定结

2.4.1 干扰素细胞安全浓度检测

利用MTT法，在Vero细胞上检测干扰素蛋白的安全浓度。结果表明，猪α干扰素突变体的CC50为462.7 μg/mL，参考序列蛋白的CC50为402.9 μg/mL，二者对细胞活性的影响呈现浓度依赖性，倍比稀释到约25 μg/mL后对细胞增殖没有影响(如图6)。

2.4.2 抗病毒活性检测结果

采用细胞病变抑制法，在Vero/VSV系统测定猪干扰素的抗病毒活性。检测结果表明，猪α干扰素突变体表现出较高的抗病毒活性，突变体蛋白活性为1.63×106IU/mg。利用TCID50和Real-time PCR测定病毒滴度和基因拷贝数，结果显示猪α干扰素能够有效地抑制VSV增殖，与参考序列蛋白相比差异显著，具有更高的生物活性。

图6 细胞活性检测

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同

图8 VSV基因拷贝数测定

3 讨论

猪α干扰素具有速效广谱的抗病毒效应，在预防和治疗病毒性疾病方面发挥着不可替代的作用[14]。近年来，国内外许多学者利用原核、真核和杆状病毒等表达系统对干扰素进行表达[15-17]。Lefevre等[8]在大肠杆菌中表达猪α干扰素，并对其生物活性检测。曹瑞兵等[18]对猪α干扰素密码子进行优化，获得干扰素蛋白的生物活性为6. 4×106IU/mg。王彦彬等[15]利用杆状病毒表达系统表达干扰素，蛋白在细胞上有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖。Huang等[17]利用基因工程的方法改变猪α干扰素基因并在毕赤酵母中大量表达，获得了具有高活性的干扰素。

研究表明，改变人IFNα2的3个氨基酸位点H57Y、E58N和Q61S，可使其活性相比野生型人IFN-α2得到提高[19]。人干扰素α和猪α干扰素同源性高达70%，因此本试验采用融合PCR的方法克隆包含58、59和61位氨基酸突变位点的猪α干扰素突变体基因，利用大肠杆菌系统表达突变体，优化蛋白纯化方式，缩短了纯化时间，更加适合大规模制备和生产应用。

本试验利用试剂盒检测纯化后的猪α干扰素内毒素残留，结果表明，内毒素含量低于1 EU/mg，符合细胞因子制品标准。MTT试验结果表明突变体蛋白的抗增殖能力呈现浓度依赖性，在蛋白浓度为25 μg/mL时，不影响Vero细胞增殖，对细胞无毒性。试验还运用TCID50和Real-time PCR方法分别从病毒滴度和病毒基因拷贝数上探究猪α干扰素抑制VSV增殖的能力。结果表明，YNS突变体和参照序列蛋白均能显著降低VSV的病毒滴度和基因拷贝数，YNS突变体抑制病毒增殖作用更明显，与参照序列蛋白相比降低约2个病毒滴度和2log10病毒基因拷贝数。

王彦彬等[16]，通过对干扰素与其受体IFNAR2三级结构分析，突变猪α干扰素与受体结合的氨基酸位点，可以使猪α干扰素与受体更快、更紧密的结合，从而使干扰素活性增强，但是具体某个氨基酸的改变对干扰素活性影响较大，仍需进一步探究。

总之，本研究成功构建了新型猪α干扰素YNS突变体，表达纯化后具有较高的生物活性，为干扰素的临床应用提供理论基础。