不同日龄王锦蛇小肠大小、组织学参数和酶活性的变化

2020-12-09姚利刘溯源伍亮徐文宁吴文欣吴海燕王鑫高乐文张志强

畜牧与兽医 2020年12期

姚利，刘溯源，伍亮，徐文宁，吴文欣，吴海燕，王鑫，高乐文，张志强*

(1. 安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；2. 安徽农业大学信息与计算机学院，安徽合肥 230036)

表型可塑性(phenotypic plasticity)是指在环境影响下，某一基因型在表型上产生变异的能力。食物可诱导成体爬行动物的消化系统在器官大小、组织学和生理学层次表现出可塑性[1-3]。幼蛇的早期生活史阶段，如出壳、蜕皮和开口摄食的早晚及成功率，不但能影响其后续的生活史进程，也是蛇类养殖需要解决的主要难题之一[4]，但关于蛇类组织器官发育可塑性(developmental plasticity)的研究较少[5-9]。幼蛇的免疫功能随日龄增加而逐渐完善[5-6]，且受食物蛋白浓度的影响[7]；30日龄内虎斑颈槽蛇(Rhabdophistigrinus)的小肠组织学参数[8]及50日龄内滑鼠蛇(Ptyasmucocus)消化道5-羟色胺细胞的形态和分布密度[9]，均在开口摄食前后变化较大。目前，与体重、体长和体全长等整体反映蛇体健康状态和营养水平的指标相比[10-12]，对不同生活史阶段蛇类小肠大小、组织学参数和消化酶活性的变化仍缺乏研究。

王锦蛇(Elaphecarinata)属于游蛇科(Colubridae)锦蛇属动物，是一种适于人工养殖的无毒蛇，幼蛇喜食蛋白含量高的人工配合饲料，但难以消化淀粉类物质[7,13]。本研究选取出壳后3、7～10、20、30、40和50日龄的王锦蛇幼蛇，测定其身体及小肠长度和重量、组织学参数和消化酶活性的变化，以阐明小肠形态和功能建立，及其与特定生活史阶段的关系，为王锦蛇幼蛇开口饵料研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

于2018年8月上旬从池州市龙井山蛇类驯养专业合作社购买10窝王锦蛇蛇蛋，每窝10个。在安徽农业大学动物生理生态学实验室内孵化蛇蛋，空调控制室温为(28 ± 2) ℃。将同一窝蛇蛋置于同一个长×宽×高=25 cm×12 cm×20 cm的塑料盒中，盒底铺手握不松散的湿沙，盒上方覆盖不滴水的湿纱布，孵化湿度为80%左右。将不同窝同一日龄出壳的幼蛇，置于同一爬宠饲养盒(长×宽×高=28 cm×18 cm×15 cm)内饲养，水自取，首次蜕皮后开始喂食乳鼠或脱毛雏鸡，每隔3～5 d投喂1次。取出壳后3、7～10 (首次蜕皮)、20、30、40和50日龄的王锦蛇，至同一日龄组达到8条幼蛇为止。

1.2 主要试剂和用品

苏木精、伊红、蛋白酶活性测定试剂由合肥博美生物科技有限责任公司提供；苦味酸、甲醛由合肥志宏生物技术有限公司提供；95%乙醇、无水乙醇、二甲苯由合肥中皖化学试剂有限公司提供；考马斯亮蓝法(A045-2)、麦芽糖酶(A082-3)和海藻糖酶(A149)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。生物组织用分析纯固体石蜡(熔点：58～60 ℃)、载玻片、盖玻片、中性树胶、直尺、塑料盒、爬宠饲养盒等均为市售产品。

1.3 动物解剖和组织学参数测定

测定王锦蛇幼蛇的体重和体全长后，断头处死，解剖取出消化道，测量小肠长度和湿重后，截取小肠前段、中段和后段各约1 cm，投入不含冰醋酸的Bouin氏液固定18～24 h后，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm。采用改良的Harris苏木精染液[14]显示小肠前段、中段和后段各部位的组织学参数。剩余小肠组织称重后，-20 ℃冷冻保存，用于测消化酶活性。重长比(g/cm)=体重(g)/体全长(cm)；小肠湿重指数(%)=小肠湿重(g) × 100/体重(g)；小肠长度指数(%)=小肠长度(cm) × 100/体全长(cm)。

使用数码显微镜观察，拍照。利用Motic Images Plus 2.0软件测量小肠前段、中段和后段组织学参数[15]，即横截面直径(40×，图1A)、肌层厚度(100×，图1B)、绒毛高度(从圆形平滑肌层的内侧边缘至黏膜层的最外缘，100×，图1B)及肠道柱状上皮细胞短径与长径(位于绒毛顶端的肠道柱状上皮细胞，400×，图1C)。每条幼蛇小肠前段、中段和后段各随机选取1张切片，每张切片上的同一组织学参数计数3次，以其平均值表示该条幼蛇前段、中段或后段组织学参数的大小，以8条幼蛇的平均值表示该发育阶段小肠前段、中段或后段组织学参数的大小。

A. 小肠中段直径(D)；B. 小肠中段肌层厚度(ME)和绒毛高度(VH)；C. 小肠中段柱状上皮细胞短径(箭头所指，ED)和长径(EH)

1.4 消化酶活性测定

1.4.1 组织匀浆

取小肠组织0.2～1 g，在冰冷的生理盐水中漂洗剪碎，放入玻璃匀浆管中，用可调高速匀浆机在10 000～15 000 r/min条件下研磨成20%组织匀浆液，2 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.4.2 消化酶活性测定

小肠组织蛋白含量用考马斯亮蓝法按试剂说明书测定；之后，按照麦芽糖酶、海藻糖酶活性测定试剂盒说明书，用722型分光光度计，分别在505 nm和550 nm处比色，测定吸光值。一定条件下(37 ℃、pH=6.0)麦芽糖酶活性大小定义为：1 mg蛋白组织每分钟水解1 nmol麦芽糖为一个酶活性单位(IU/mg prot)；海藻糖酶活性大小按照蛋白浓度计算，1 mg底物每分钟水解1 nmol海藻糖为一个酶活性单位(IU/mg prot)。

采用福林酚法测定蛋白酶活性，水浴温度为35 ℃[16]。通过标准酪氨酸溶液(100 μg/mL)设置6个浓度梯度，与Na2CO3溶液和福林酚试剂混合后，在680 nm下比色测定吸光值，绘制标准曲线。之后，采用福林酚试剂法测样品的蛋白酶活性，以10%三氯乙酸中止反应，680 nm下比色测定吸光值。蛋白酶活性的定义为：35 ℃、pH 7.5条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个酶活性单位(IU/g prot)。

1.5 数据统计分析

用SPSS 19.0 for windows进行数据处理。用单因素方差分析(One-way ANOVA)及多重比较(Multiple comparisons) Post hoc test统计出壳后3、7～10、20、30、40和50日龄组王锦蛇体重、体全长、重长比、小肠湿重指数、小肠长度指数、组织学参数(直径、肌层厚度、绒毛高度、肠道柱状上皮细胞短径和长径)和消化酶(麦芽糖酶、海藻糖酶和蛋白酶)活性的组间差异。文中数据均以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 王锦蛇体重、体长、重长比和小肠大小的变化

王锦蛇体重各组间无显著差异(F5，42=2.029，P>0.05，图2A)，体全长50日龄组显著长于3日龄组(F5，42=3.330，P<0.05，图2B)，其他日龄各组之间都无显著差异；重长比3日龄组显著高于20、30和40日龄组(F5，42=4.191，P<0.05，图2C)，7～10和50日龄组与任一日龄组均无显著差异；小肠长度指数30日龄组与20、40和50日龄组接近，但显著高于3日龄组和7～10日龄组(F5，42=10.559，P<0.05，图2D)；小肠湿重指数50日龄组最高，且显著高于其他日龄组，3日龄组小肠湿重指数最低(F5，42=8.305，P<0.05，图2E)。

注：柱形图上标注的小写字母不同，表示日龄间的差异显著(P<0.05)，小写字母相同表示日龄间差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 王锦蛇小肠组织学参数的变化

小肠前段直径3日龄组最高，7～10日龄组其次，3日龄组显著高于20和40日龄组(F5，42=5.048，P<0.05)，中段(F5，42=0.639，P>0.05)和后段(F5，42=1.602，P>0.05)无日龄差异。小肠前段肌层厚度3和50日龄组都显著高于20日龄组(F5，42=3.907，P<0.05)，中段50日龄组显著高于30日龄组(F5，42=2.704，P<0.05)，后段(F5，42=1.225，P>0.05)无日龄差异。小肠前段绒毛高度3日龄组最高，50日龄组其次，3日龄组显著高于除50日龄组外的其他日龄组(F5，42=7.395，P<0.05)，中段无日龄差异(F5，42=0.858，P>0.05)，后段50、30和20日龄组都显著高于40日龄组(F5，42=3.941，P<0.05)。小肠前段柱状上皮细胞短径3和30日龄组显著高于7～10日龄组(F5，42=3.769，P<0.05)，中段3日龄组显著高于20和40日龄组(F5，42=2.517，P<0.05)，后段(F5，42=1.712，P>0.05)无日龄差异。小肠前段柱状上皮细胞长径50日龄组显著高于7～10日龄组(F5，42=3.881，P<0.05)，中段(F5，42=2.258，P>0.05)和后段(F5，42=1.489，P>0.05)无日龄差异(表1)。

表1 王锦蛇小肠前段、中段和后段组织学参数的增龄变化

麦芽糖酶活性呈波浪形波动，但日龄组间的差异不显著(F5,42=2.218，P>0.05，图3A)；海藻糖酶活性3日龄和7～10日龄组都显著高于50日龄组(F5,42=5.204，P<0.05，图3B)，其他日龄组间的差异不显著；蛋白酶活性40日龄组显著高于3日龄组(F5,42=4.334，P<0.05，图3C)，其他日龄组间的差异不显著。

图3 王锦蛇小肠麦芽糖酶(A)、海藻糖酶(B)和蛋白酶活性(C)的变化

3 讨论

在蛇类生长发育的早期阶段，与体重、体全长等相比，重长比这一指标能更全面地反映蛇体的健康状态，具有可塑性[5-7, 17]。与灌喂8%、12%和24%蛋白含量的食物组相比，16%和20%蛋白含量食物组的王锦蛇的重长比增幅最快[7]。50日龄内，滑鼠蛇的重长比3～20日龄阶段增长缓慢，之后快速增加，至50日龄达到最高值[6]。然而，与滑鼠蛇不同，本研究发现王锦蛇的重长比以3日龄时为最高，20～40日龄下降，至50日龄后又回升，这可能与其初生重重于滑鼠蛇有关[6]。王锦蛇出壳后体内含有来源于胚胎时期的大量脂肪，可供首次蜕皮前的幼蛇消耗使用，且随日龄增加而逐渐减少。与出壳后3 d相比，王锦蛇在首次蜕皮和开口摄食前后，其体重均有小幅度下降，但体全长逐渐变长，故重长比趋于降低。本研究以乳鼠刺激王锦蛇开口摄食，开口后喂食脱毛雏鸡，乳鼠和雏鸡都是王锦蛇喜好的食物，幼蛇从食物中获得营养物质后，其生长发育速度加快，所以重长比趋于增加。

成体两栖爬行动物小肠大小和组织学参数的可塑性与季节[18]、饥饿胁迫[19]等因素有关，小肠重量可能先于长度改变[3]，消化酶活性随季节而波动，但不受食物成分影响[20]。王锦蛇出壳后小肠大小、组织学参数和消化酶活性都发生了适应性改变，可能与其食性及早期复杂的生活史有关。野外条件下，王锦蛇食性广泛，可捕食鼠、鸟、鸟蛋及其他小型动物[4]，本研究以乳鼠和脱毛雏鸡作为王锦蛇的食物来源，能满足其生长发育需要[7]。50日龄内，王锦蛇经历了出壳、首次蜕皮和开口摄食等多个关键生活史阶段，小肠长度和湿重指数分别在30和50日龄组最高，长度先于湿重发生改变，与成体对饥饿的反应相反[19]，这可能与在食物资源充足情况下，幼蛇囫囵吞食且贪食，开口后摄食频率较高，需要更大的空间及更长的时间来处理和消化食物有关。小肠是执行消化吸收功能的主要场所，从前段至后段消化吸收能力逐渐减弱[4]。本研究发现王锦蛇小肠前段的直径、肌层厚度、绒毛高度、肠道细胞短径和长径等参数都在3和/或50日龄组最高，7～10、20或30日龄组最低，呈现出先降后升的变化趋势，说明40～50日龄小肠的形态发育仍未趋于稳定，晚于虎斑颈槽蛇的30日龄[8]。王锦蛇小肠中段柱状上皮细胞的短径3日龄组显著高于20和40日龄组，肌层厚度50日龄组显著高于30日龄组，但柱状上皮细胞的长径无明显变化，小肠后段的绒毛高度在40日龄组显著下降，这可能与其消化生理状态有关，紧缩的短径和萎缩的绒毛有助于蛇体节约能量[2,19]。与小肠前段组织学参数的变化不同，王锦蛇小肠麦芽糖酶活性无明显的日龄差异，这与其对淀粉类物质消化能力较差有关[11,13]。然而，海藻糖酶活性3日龄组和7～10日龄组均显著高于50日龄组，说明王锦蛇出壳后和开口摄食前的体内脂肪经代谢后可转化为糖原，而海藻糖酶是广泛存在于小肠上皮细胞膜刷状缘的一种胞外酶，能催化水解一分子海藻糖生成两分子葡萄糖[20]，王锦蛇早期生活史阶段小肠海藻糖酶含量较高，这有利于其存活。海藻糖酶活性在王锦蛇主动摄食后趋于下降，并在50日龄组达到最低值，而蛋白酶活性40日龄组显著高于3日龄组，说明开口摄食后以水解糖类为主的酶类钝化，蛋白水解酶活性增强，这与小肠消化和吸收功能的建立相匹配，建议可在40～50日龄期间提高王锦蛇食物中的蛋白含量、加大投喂频率。