细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达

秦中勇，石晓，曹平平，褚鹰，管蔚，杨楠，程禾，孙玉洁

研究报告

细胞凋亡反应中基因启动子发挥增强子功能调节基因表达

秦中勇1,2，石晓1,2，曹平平1,2，褚鹰1,2，管蔚4，杨楠1,3，程禾1,2，孙玉洁1,2

1. 南京医科大学，江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京 211166 2. 南京医科大学细胞生物学系，南京 211166 3. 南京医科大学生物化学与分子生物学系，南京 211166 4. 南京医科大学第一附属医院，南京 210029

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控，部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。与分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现，基因启动子与基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用，且基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控基因表达，本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture, 3C)、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实，启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控基因表达。启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关，在较弱凋亡信号刺激下(1 μmol/L喜树碱处理)，启动子主要发挥增强子功能；随着凋亡刺激信号的加强(10 μmol/L喜树碱处理)，启动子活性增强，主要调控其基因自身的表达，促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)证实启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

启动子；增强子；双重调控功能；基因；细胞凋亡

真核生物中基因转录是非常复杂的过程，反式作用因子需要通过识别各种类型的DNA调控序列来实现基因的转录调控，启动子和增强子是最具代表性也是研究最广泛的两类顺式转录调控元件[1~4]。启动子通常定位于基因的5ʹ末端，包含TATA盒、下游核心启动子等元件组分，可以与RNA聚合酶II (RNAP II)结合，并确定转录起始位置和方向[5,6]。增强子大多具有组织或细胞特异性，可以在远端通过形成染色质环的方式与靶基因启动子充分接近，协助靶启动子募集转录因子和辅转录因子，从而加速靶基因的转录，以确保基因在时间空间上正确表达[7~9]。

区别增强子和启动子的主要依据它们相对于基因5ʹ末端的位置以及特异性组蛋白修饰的富集[1,10,11]。从所在位置来看，增强子具有激活远端启动子的特性，而与其靶基因的位置和方向无关，启动子则只能启动近端基因转录。启动子和增强子可以通过区域内特异性的组蛋白修饰来进行预测和分析，活性增强子通常富含组蛋白H3 Lys4的一甲基化(H3K4me1)和组蛋白H3 Lys27乙酰化(H3K27ac)修饰[12~15]，启动子则通常表现为组蛋白H3 Lys4的三甲基化(H3K4me3)修饰。因此，H3K27ac的存在伴随着高水平的H3K4me1和低水平的H3K4me3被视作活性增强子的标志。具有增强子功能的启动子兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰，并与其他启动子形成远距离的相互作用[4,16]。虽然通过高通量的方法，越来越多的增强子样启动子被鉴定了出来，然而对其生物学功能的探究甚少[16~18]，研究增强子样启动子在特定生理病理条件下发挥的功能和调控方式可以帮助人们全面认识转录调控网络。

和基因定位于人18号染色体上，所编码的蛋白分别为BCL2蛋白家族重要的促凋亡和抗凋亡成员[19~23]。BCL2蛋白家族抗凋亡成员包括BCL-2、BCL-W、A1等，促凋亡成员又分为凋亡效应物(Bax、Bak)和凋亡激活物(Bim、Bid、Puma、NOXA等)，各个成员转录水平在正常生理状态下的比例维持稳定，精密调节细胞凋亡。一旦细胞受到凋亡信号的刺激，如药物暴露、营养条件匮乏、氧化应激等刺激因素会打破两种基因的转录平衡[19,24,25]，抗凋亡成员如的基因水平会被下调，而凋亡激活成员等会过度表达激活凋亡效应物的寡聚化，寡聚化的凋亡效应物会转移至线粒体外膜进行穿孔，释放细胞色素C，激活Caspase途径的细胞凋亡。

本课题组前期在Jurkat细胞中发现与基因均可被增强子mbr通过形成染色质环的方式所调控，而启动子与启动子存在空间上的相互作用，敲除mbr后两启动子的相互作用依然存在[26~30]。无独有偶，在乳腺癌细胞系MCF-7和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中本课题组也检测到了和启动子的相互作用，同时在数据库查询发现启动子区兼具启动子和增强子特征性的组蛋白修饰。这一有趣的现象激发了对启动子的转录元件属性和BCL2家族基因调控新机制的思考。因此，本研究旨在探究启动子是否具有增强子活性、能否作为增强子调控基因表达及什么情况下发挥增强子功能。这对认识基因调控元件属性切换的条件和意义将有新的启发。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌细胞系MCF-7、正常乳腺上皮细胞MCF-10A购买自美国ATCC细胞库。

MCF-10A所用培养液为DMEM-F12培养基，并添加终浓度为5%的马血清和4种生长因子(浓度为0.02 μg/mL EGF生长因子、10 μg/mL胰岛素、0.5 μg/mL氢化可地松、0.1 μg/mL霍乱毒素)以及两种抗生素：100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。MCF-7所用培养液为MEM培养基，并添加终浓度为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及0.2 U/mL胰岛素。上述两种细胞在CO2浓度为5%、温度为37℃的恒温培养箱中进行培养。

1.2 载体构建

利用GenBank数据库查询、基因转录起始位点上游1000 bp至下游500 bp的序列为基因的启动子区，利用Prime 5.0软件设计合适的PCR引物，并选择合适的酶切位点。将PCR片段插入到pGL3-basic质粒荧光素酶报告基因上游检测启动子活性，插入pGL3-promoter质粒荧光素酶报告基因下游检测增强子活性，所用PCR片段与相应质粒使用同种限制酶切割，利用清洁回收试剂盒(广州美基生物)纯化后进行连接，转化导入大肠杆菌DH5α中，随后挑取单菌落扩增，鉴定阳性克隆。

1.3 细胞凋亡模型

取处于对数生长期的MCF-7细胞和MCF-10A细胞，接种于6孔板和24孔板中，培养24 h后用不同浓度(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μmol/L) 的喜树碱(camptothecin, CPT)处理10 h后，收取细胞，分别检测、基因的RNA水平以及各个喜树碱浓度下的细胞凋亡水平；同时将空载的对照组质粒、重构的pGL3-basic、pGL3-promoter质粒分别与内参海肾荧光素酶荧光素酶质粒pRL-SV40按质量比为1000∶1的比例，利用脂质体Lipfectamine 3000 (Thermo Fisher，美国)共转染进细胞，4~6 h后用上述浓度梯度的喜树碱处理相同时间(10 h)，检测各浓度喜树碱下的启动子的启动子活性和增强子活性。综合分析细胞凋亡程度、和的RNA变化水平以及启动子不同方面的转录元件活性。

1.4 RNA提取和 qRT-PCR

采用Trizol法提取细胞总RNA，利用试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行逆转录，各个样品取500 ng总RNA进行逆转录后，按1∶10稀释比例稀释各组cDNA，以稀释后的cDNA为模板，配制SYBR Green I Master Mix体系(Roche，瑞士)，使用Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)检测、以及内参基因的表达变化，所用引物如下，RT-NOXA- F：5ʹ-GCAGAGCTGGAAGTCG­AGTGT-3ʹ；RT-NOXA- R：5ʹ-CTCTTTTGAAGGA­GTCCCCTCAT-3ʹ；RT-BCL2- F：5ʹ-TCGCCCTGTGG­ATGACTGAG-3ʹ；RT-BCL2- R：5ʹ-CAGAGTCTTCA­GAGACAGCCAGGA-3ʹ；RT- β-Actin-F：5ʹ-TCATGA­AGTGTGACGTGGACAT-3ʹ；RT-β-Actin-R：5ʹ-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG- 3ʹ。PCR扩增程序为：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s；35个循环，采用2–ΔΔCt法分析定量PCR数据。

1.5 细胞凋亡检测

使用凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司)检测细胞凋亡。每组收集1×105个细胞，洗涤并重悬，加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution避光、室温孵育染色；随后加入Binding Buffer，轻轻混匀，染色后样品在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(BD，美国)。流式细胞仪激发波长为488 nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL3 通道检测，每个样本采集10000个细胞。用Cell Quest软件进行数据分析，FL1为横坐标，FL3为纵坐标，根据FITC和PI荧光值确定两荧光参数阴阳界限，划定十字门。其中细胞可分为三个亚群：活细胞为双阴性(Annexin V-FITC–/PI–)；早期凋亡细胞为Annexin V-FITC单阳性(Annexin V-FITC+/PI–)；晚期凋亡细胞为Annexin V-FITC和PI双阳性(Annexin V-FITC+/PI+)。

1.6 染色质免疫共沉淀(chromatin immuno­precipitation, ChIP)

使用ChIP试剂盒(CST，美国)进行实验，收集1×107个细胞，将细胞在室温下用含1 %甲醛的培养基交联固定10 min，接着用甘氨酸终止交联，裂解细胞后用超声破碎仪(SONICS，美国)将基因组DNA剪切成200~1000 bp的短片段，离心后取上清用ChIP Buffer稀释分别用H3K4me1和H3K4me3抗体(Millipore，美国)在4℃孵育过夜。次日，加入磁珠4℃孵育2 h后进行洗涤，之后在65℃水浴中解交联、吸附柱纯化DNA。最后取ChIP产物进行qRT-PCR分析，检测启动子区H3K4me1和H3K4me3药物处理前后的变化情况，所用引物为ChIP-F：5ʹ- GTTGTTCTGAGGACGGAATG-3ʹ；ChIP-R：5ʹ-GCA­TAATGTTTGGCGAGGC-3ʹ。qRT-PCR扩增程序为：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s；35个循环。以Input的Ct值作为校正值，采用2–ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.7 染色质构象捕获(chromosome conforma­tion capture, 3C)

收集1×106个细胞，用2 mL含2%甲醛的培养基，在室温下交联固定细胞5 min，用浓度为0.125 mol/L的甘氨酸终止交联。随后用1.25 mL 3C裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、pH=8.0、10 mmol/L NaCl、0.2% NP-40)在4℃条件下翻转孵育60 min。之后进行分步酶切：每管样品加入135.2 μL ddH2O、20 μL NEB buffer、4.4 μL 10% SDS在37℃摇床中孵育1 h；加入32.4 μL浓度10%的Triton在37℃摇床中孵育1 h；再加入8 μLd Ⅲ 限制性内切酶(NEB，美国)在37℃摇床中孵育过夜(22 h左右)；然后每管加入38 μL 10% SDS (终浓度1.6%) 65℃水浴20 min使酶失活；随后取40 μL上一步酶切产物加入70 μL NEB Buffer、140 μL Triton、444 μL ddH2O进行在16℃水浴中连接过夜。最后连接产物用酚氯仿抽提纯化，取200 ng DNA为模板，用以下4条引物引物A：5ʹ-GTCTAAGAGTAGCTCCTGTA-3ʹ；引物B：5ʹ-CTAAATCTAAACAGAGAACCCA-3ʹ；引物C：5ʹ-GTTTGAGAATGATGAATGATTTG-3ʹ；引物D：5ʹ-TAACATTCCTTCTGTGCTGCTA-3ʹ的不同组合来扩增3C产物，Loading control扩增的序列不含所选酶切位点，以检测基因组DNA的完整性，所用引物为：Loading control-F：5ʹ-GAAATCGTG­CGTGACATTAA-3ʹ；Loading control-R：5ʹ-AAGG­AAGGCTGGAAGAGTG-3ʹ，上述PCR采用Hot Star (Qiagen，德国)体系扩增。

1.8 双荧光素酶活性检测

本实验采用Dual Luciferase Reporter Assay Kit (南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行，收取24孔板中的细胞，每孔加入100 μL 1×Cell Lysis Buffer，室温条件下裂解5~ 10 min后，吹打并吸取全部细胞裂解产物至1.5 mL EP管中，常温下12,000离心5 min，取上清用于后续检测。向100 μL Luciferase Substrate中加入20 μL上清，检测萤火虫荧光素酶读值，记为RLU1，随后加入100 μL经Stop & Reaction Buffer稀释的1× Renilla Substrate，该步操作可以终止萤火虫荧光素酶的反应并起始海肾荧光素酶的反应，将海肾荧光素酶的检测读值记为RLU2，计算每个样品RLU1/ RLU2的比值，并进行统计分析。

1.9 统计学分析

实验数据以3次实验的平均值和标准误(mean± SEM)表示。组间比较用双尾检验并计算值，*表示<0.05，差异有统计学意义；**表示<0.01，差异显著。

2 结果与分析

2.1 NOXA基因的启动子具有增强子活性

通过查询UCSC数据库[31]启动子区和启动子区组蛋白ChIP-seq数据，发现基因启动子区兼有增强子和启动子特征性的组蛋白修饰的标记H3K4me1、H3K4me3以及H3K27ac (图1A)，提示其可能为增强子样启动子。利用双荧光素酶报告基因系统，分别构建不同类型的报告基因质粒，转染进正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7中检测这两个启动子的转录元件活性[32,33]。实验结果显示，启动子和启动子均能起始荧光素酶报告基因的转录(图1B)；而启动子兼具增强子活性，启动子则未检测到增强子活性；为了进一步验证启动子作为增强子时是否具有方向性，将启动子序列翻转后插入pGL3-promoter质粒报告基因的下游，结果并未检测到荧光强度上调(图1C)。结果表明，与经典增强子有所不同，启动子发挥增强子功能时有方向效应，序列翻转后增强子活性消失。

2.2 NOXA启动子与BCL2启动子存在相互作用

本课题组前期在Jurkat细胞中发现启动子与基因启动子存在空间上的相互作用，为

了验证在乳腺癌MCF-7细胞中的情况，本研究开展了3C实验[34~36]。实验原理及引物设计如图2A所示，即细胞在甲醛交联状态下，利用限制性内切酶d Ⅲ进行切割后，再利用T4 DNA连接酶进行连接，如果两启动子序列在空间上足够接近，则可被分别设计在序列两端的单向引物的组合而扩增出PCR产物。实验结果显示，利用位于启动子的上游的引物A和位于启动子下游的引物C组合可成功扩增出217 bp的PCR的产物(图2B)。对此PCR产物的DNA测序结果证实产物DNA序列一部分来自基因启动子，另一部分来自基因启动子(图2C)。该实验结果提示启动子与启动子可以形成染色质环，从而在空间上靠近。结合荧光素酶报告基因的实验结果，提示启动子可能作为增强子调控的表达。

2.3 NOXA启动子作为增强子激活BCL2启动子

为验证启动子对启动子的调控作用，构建了不同类型的荧光素酶报告基因质粒，将基因启动子插入至报告基因上游，发挥启动子的作用；将启动子插入至报告基因的下游，验证其是否可以作为增强子促进上调启动子的转录活性(图3A)。结果显示在MCF-7细胞中，启动子位于荧光素酶报告基因下游时，未检测到报告基因的表达(图3B，②)，排除了启动子反向激活报告基因的情况[37~39]。当启动子位于报告基因上游，启动子位于荧光素酶报告基因下游时(图3B，④)，报告基因的活性比上游仅存在启动子时(图3B，③)上调了2.5倍左右，也即说明启动子可以作为增强子促进启动子转录，结合3C的结果可以说明启动子可作为增强子调控基因。

2.4 喜树碱诱导NOXA基因的启动子向增强子转变

喜树碱是重要的抗肿瘤药物[40,41]，通过靶向抑制DNA拓扑异构酶I[42]，引起细胞内DNA不可逆损伤，诱导细胞凋亡反应[40]。为建立紫杉醇诱导的细胞凋亡模型，分别用低浓度(1 μmol/L)和高浓度(10μmol/L)喜树碱处理MCF-7细胞10 h后用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示用1 μmol/L和10 μmol/L喜树碱处理时MCF-7细胞凋亡比例分别为6.6%和11.5% (图4A)。同步检测NOXA启动子的转录元件活性，发现启动子的增强子活性在1 μmol/L喜树碱刺激时处于最高水平，此时启动子活性无明显变化；10 μmol/L喜树碱处理细胞时启动子活性最强而增强子活性弱(图4，B和C)。同时依据ENCODE数据库[43]MCF-7细胞中特征性的组蛋白修饰峰图设计ChIP引物(图4D)，检测基因启动子区的增强子和启动子特征性组蛋白修饰标记H3K4me1和H3K4me3的变化(图4，E和F)，用H3K4me1/H3K4me3的比值来表征基因组上启动子区的转录元件属性，结果显示1 μmol/L喜树碱处理时H3K4me1/ H3K4me3的比值最高，此时启动子主要作为增强子发挥作用，而10 μmol/L喜树碱处理时H3K4me1/H3K4me3的比值最低，启动子发挥启动子本身的作用(图4G)。这与上述报告基因中得到启动子和增强子活性的变化结果是一致的。我们推断用1 μmol/L和10 μmol/L喜树碱处理细胞时，启动子发挥的转录元件的属性不同。在平行实验中，本研究利用qRT-PCR分析了和基因的表达情况。结果显示在不同药物浓度的处理下，的浓度均有下降，但在1 μmol/L喜树碱处理时，即启动子的增强子活性最强的时候，下降幅度最小，而用10 μmol/L喜树碱处理时，即启动子活性最强时，下降幅度较大，而此时mRNA处于最高水平。这些结果提示启动子在低浓度药物下可作为增强子调控，高浓度喜树碱刺激下主要作为启动子起始自身基因的表达(图4，H和I)，进一步证实了启动子作为增强子对的调控作用。

图1 分析和鉴定NOXA基因启动子的增强子活性

A：UCSC数据库数据显示的基因启动子区(上图)和基因启动子区(下图)的组蛋白H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac修饰特征。B：启动子活性验证。将启动子和启动子分别插入至pGL3-basic荧光素酶基因上游后转染进MCF-10A、MCF-7细胞中(对照为pGL3-basic空载质粒)，验证二者的启动子活性；C：增强子活性验证。将启动子和启动子分别插入至pGL3-promoter荧光素酶基因下游后转染MCF-10A和MCF-7细胞(对照为pGL3-promoter空载质粒)，检测二者的增强子活性，结果显示启动子兼具有增强子活性。D：翻转启动子后增强子活性验证。将启动子翻转后插入至pGL3-promoter荧光素酶基因下游后转染MCF-10A和MCF-7细胞(对照为pGL3-promoter空载质粒)，检测启动子翻转后的增强子活性。*：<0.05；**：<0.01。

图2 3C证明NOXA启动子与BCL2启动子存在空间互作

A：基因与基因的相对位置示意图。染色质构象捕获实验的原理以及所用的酶切位点和引物位置。黑色倒三角表示d Ⅲ限制性内切酶识别位点、白色空心箭头表示引物设计的位置及其扩增方向、红色标注的是启动子区、绿色标注的序列为启动子区。B：MCF-7细胞中的3C结果。上方DNA琼脂糖凝胶电泳图从左至右泳道依次为DNA Marker、交联连接、交联不连接、不交联连接、不交联不连接的3C产物PCR结果，交联且连接处的条带由引物A和引物C组合扩增产生。C：实验组PCR产物TA克隆后进行Sanger测序结果。

图3 荧光素酶报告基因实验证实NOXA启动子对BCL2启动子的增强子效应

A：不同类型的报告基因质粒模式图。分别显示各调控序列与报告基因的相对位置以及两个调控序列间的相对位置。当位于报告基因下游的调控序列具有增强子活性时，可增强上游基因启动子的活性。B：荧光素酶报告基因活性检测。分别将上述报告基因质粒转染至MCF-7细胞中，检测其荧光素酶报告基因的活性所得结果，以确定基因启动子序列对基因启动子的增强子效应。**：<0.01。

3 讨论

本研究以和基因启动子间的相互作用为切入点，鉴定了一个新的具有增强子功能的启动子—启动子。启动子可通过形成染色质环结构远程调控基因表达。启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关，在较弱凋亡信号刺激下(1 μmol/L喜树碱处理)，启动子主要发挥增强子功能，随着凋亡刺激信号的加强(10 μmol/L喜树碱处理)，启动子活性增强，主要调控其基因自身的表达，促进细胞凋亡。

在喜树碱诱导的细胞凋亡模型中，细胞中的mRNA水平是呈药物浓度依赖性的下降，即药物浓度越高的转录水平下降越多，结合启动子表现出的增强子活性变化情况，我们推测这种现象的产生是由于细胞在应对不同程度的凋亡刺激时产生的不同反应。当轻微凋亡刺激时，促凋亡基因启动子活性较低，表达水平不高，而与此同时启动子表现较高增强子水平，使本该急剧下降的抗凋亡基因表达只有轻微下降；当强烈的凋亡刺激作用于细胞时，细胞凋亡不可挽回，此时启动子活性升高，其增强子活性降低，导致表达水平上升，表达水平进一步下降，细胞走向凋亡[19,21,44,45]。启动子作为的增强子在这里以一种“刹车机制”来发挥增强子作用，因其不是激活的表达而是拮抗的转录下调。本研究揭示了启动子作为增强子样启动子参与了细胞凋亡进程，在发挥启动子或增强子功能时受不同强弱凋亡信号的调节，对认识基因转录调控元件的转换和激活的调控机制及在生物学进程中的意义有新的启发。有意思的是基因启动子作为增强子时所调控的靶基因是同家族中与其蛋白功能相互拮抗的成员，这有助于人们更好地了解BCL2家族各成员之间的联系，为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

图4 喜树碱诱导NOXA基因启动子向增强子转变

A：喜树碱处理后各组凋亡情况。分别以低浓度(1μmol/L)和高浓度(10μmol/L)喜树碱处理MCF-7细胞10 h，收获细胞后运用流式细胞术测定细胞凋亡。B和C：利用报告基因系统分别检测不同浓度喜树碱处理MCF-7细胞后10 h后，NOXA基因启动子和增强子活性变化。D：ENCODE数据库中的MCF-7细胞H3K4me1和H3K4me3修饰的ChIP-seq数据。红框圈出的部分为H3K4me1和H3K4me3组蛋白修饰重叠区域，在该部分设计合适的ChIP引物。E和F：利用ChIP验证不同浓度喜树碱处理MCF-7细胞后启动子区组蛋白修饰H3K4me1和H3K4me3的变化。G：ChIP数据H3K4me1/H3K4me3的比值变化。H：喜树碱处理MCF-7细胞基因的mRNA水平变化。I：喜树碱处理MCF-7细胞基因的mRNA水平变化。*：<0.05；**：<0.01。

细胞特异性染色质相互作用可以为细胞特异性的基因转录提供构象上的支持[33]。本课题组在多种细胞(MCF-7、MCF-10A、Jurkat细胞)均检测到了启动子与启动子在空间上的相互作用，并且在上述细胞中同时检测到了基因启动子兼具增强子活性，证明该种调控方式并不存在正常或肿瘤细胞特异性，暗示两者通过转录元件的调控是一种通用型转录调控模式。

增强子样启动子通过与靶基因启动子在空间上的相互作用来调节基因的表达[46,47]，两者空间上的接近很可能是通过引入关键的转录因子，如ZNF143或YY1[48]，据已有报道这两个因子参与了染色质环的形成，并在增强子样启动子上有着高丰度的结合[16,17]。本研究虽然初步探索了启动子向增强子转变的条件，但并未找到驱动这种转变的机制，具体的转变机制是未来需要进一步探讨的。值得注意的是，有文献报道在前列腺癌中长非编码RNA的截短异构体的启动子同时也是一个增强子[17]，作为增强子时调控全长异构体的表达，而该启动子向增强子转换的因素是一个SNP，该SNP的不同风险位点介导了不同的转录因子的结合，从而决定了SNP所在区域是启动子还是增强子，这说明启动子向增强子的转变很可能是由于一种或多种关键转录因子所介导的，这是目前极少数涉及同一序列在启动子与增强子之间转换机制的报道。已有文献报道增强子样启动子结合的转录因子数量比普通启动子大，其种类也有所不同，这引发人们联想，是否在不同生理状态或刺激下增强子样启动子如启动子可选择性结合不同的转录因子从而实现其在启动子和增强子间的转换？本课题组将细胞凋亡过程中关键转录因子SATB1在MCF-7细胞中过量表达，发现启动子活性无明显变化，而启动子的增强子活性却大幅度增加(结果未列出)，说明SATB1参与了启动子向增强子转化的过程，但是否为转化的驱动因素其具体机制如何则需要进一步的证明。

本研究工作为进一步探讨BCL2蛋白家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

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Thepromoter could function as an active enhancer to regulate the expression ofin the apoptosis response

Zhongyong Qin1,2, Xiao Shi1,2, Pingping Cao1,2, Ying Chu1,2, Wei Guan4, Nan Yang1,3, He Cheng1,2, Yujie Sun1,2

The transcription of eukaryotic genes is regulated by both proximal promoters and distal enhancers. Some promoters also have enhancer activity.andare pro-apoptotic and anti-apoptotic members of the BCL2 family of protein, respectively. Our previous study has found that thegene promoter and thegene promoter interact at the level of three-dimensional chromatin structure. Moreover, thegene promoter region displays histone modifica­tions characteristic of both promoters and enhancers. This study aimed to explore whether and when thepromoter could act as an active enhancer to regulateexpression. Based on the apoptosis model of MCF-7 cells induced by camptothecin, we used chromosome conformation capture (3C), quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and the luciferase reporter gene technology to demonstrate that thepromoter could function as an active enhancer and physically interact with thepromoter through chromatin looping. The regulatory properties of thepromoter were closely related to the strength of the apoptosis stimulation. Under weak apoptotic stimulation (1 μmol/L camptothecin treatment), thepromoter mainly functioned as an enhancer; with the enhancement of apoptotic stimulation (10 μmol/L camptothecin treatment), thepromoter activity increased and mainly regulated the expression of the gene itself to promote apoptosis.Chromatin immunoprecipitation (ChIP) confirmed that the dynamic changes of the promoter activity and enhancer activity in the NOXA promoter region are consistent with its histone modification marks. This study provides new clues for further exploring the mechanism underlying cooperative response offamily member to apoptosis stimuli.

promoter; enhancer;dual transcription regulation function;gene; apoptosis

2020-07-07;

2020-10-04

国家自然科学基金项目(编号：81172091，81572789)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81172091,81572789)]

秦中勇，硕士，专业方向：基因远程调控。E-mail: qinzhongyong1994@163.com

孙玉洁，博士，教授，研究方向：增强子生物学功能、肿瘤耐药形成机制。E-mail: yujiesun@njmu.edu.cn

程禾，博士，讲师，研究方向：乳腺癌耐药形成机制。E-mail: chenghe@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-213

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201106.1053.005.html

URI: 2020/11/9 10:47:50

(责任编委: 方向东)