麻黄附子细辛汤对局灶性节段性肾小球硬化症模型大鼠血尿生化及肾脏病理的影响

苏哲苓 卢 嫣 韩世盛 姚天文 王 怡

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肾内科，上海200437）

局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）是慢性肾炎中一种常见的病理类型，西医常用激素和免疫抑制剂治疗，但往往疗效欠佳且副作用较大。临床上常使用麻黄附子细辛汤治疗肾脏病[1-6]，但未见运用本方治疗FSGS的相关文献报道。本研究以FSGS模型大鼠作为实验对象，观察麻黄附子细辛汤对FSGS模型大鼠血、尿生化指标及肾脏病理的影响，为麻黄附子细辛汤治疗FSGS的临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级5周龄雄性Wistar大鼠，体质量（146±5）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。动物使用许可证号：SYXK（沪）2013-0109。实验动物伦理审批号：16695。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心。

1.2 药物与试剂 中药颗粒剂麻黄附子细辛汤（生麻黄6 g，制黑附子9 g，细辛3 g），江阴天江药业有限公司，批号：16101151。尿蛋白测定试剂盒，上海执诚生物科技有限公司，批号：ZCOCTR011、ZCNOVR007、ZCFEBR028；血生化试剂盒，上海科华卓越生物工程股份有限公司，批号：2016061K；Masson染色液，北京雷根生物技术有限公司，批号：DC0032；嘌呤霉素氨基核苷（PAN）试剂，美国Sigma公司，批号：113M4100V、045M4068V。

1.3 主要仪器 全自动生化仪（型号：450），上海科华卓越生物工程股份有限公司；光学显微镜（型号：CX41），日本Olympus株式会社；透射电镜（型号：Tecnai G2 spirit），美国FEI公司。

2 实验方法

2.1 分组 24只大鼠随机分为正常组、模型组与治疗组，每组8只，适应性喂养1周左右开始造模。

2.2 造模与干预 根据中日友好医院2005年发表的嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病模型造模方法，结合课题组前期成功造模方法进行造模[7]。具体方法如下：首剂静脉注射PAN 90 mg/kg，在蛋白尿达到高峰后（约第13天）分别于第14、17、20、23、26天追加PAN 9 mg/kg，造模周期为56 d（8周）。

药物干预与造模同步。大鼠药物剂量根据《心血管病实验动物学》[8]推荐剂量结合本实验肾毒性研究需要，人鼠剂量换算按每公斤体重计算为成人剂量的20倍。成人的麻黄、附子、细辛剂量按照邓中甲主编的2008版《方剂学》中麻黄附子细辛汤剂量：生麻黄6 g，制黑附子9 g，细辛3 g。制备麻黄附子细辛汤水溶液，每毫升含生药0.6 g。治疗组大鼠每日1次灌胃给药，灌胃剂量为每100 g体质量1 mL，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，均连续灌胃56 d。

2.3 指标检测

2.3.1 24 h尿蛋白定量 应用基础代谢笼收集造模第0、2、4、8周时各组大鼠24 h尿液，采用免疫比浊法检测尿蛋白。

2.3.2 血生化指标 造模第56天，各组大鼠用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后，无菌下打开腹腔，腹主动脉采血，处死，留取肾脏标本。采用溴甲酚绿法检测血浆白蛋白，采用紫外-谷氨酸脱酶法检测血尿素氮，采用肌氨酸氧化酶法检测血肌酐，采用氧化酶法检测血尿酸，采用甘油磷酸氧化酶法检测血甘油三酯，采用氧化酶法检测血总胆固醇。

2.3.3 肾小球硬化指数及肾小管间质病变程度 留取大鼠肾脏皮质组织，经10%中性福尔马林缓冲液固定后，石蜡包埋，切片厚约3 μm，行Masson染色，光镜下观察组织学变化。

采用一种半定量指标，即通过计算肾小球硬化指数（GSI）来判断肾小球的硬化程度。GSI计算公式为：GSI=[（1×n1+2×n2+3×n3+4×n4）/每片肾小球总数]×100%（n1～n4分别代表1级～4级损害肾小球个数）。在各肾组织切片中随机检测50个肾小球，将每个肾小球损害程度分为0～4级，0级表示肾小球无病变，1级表示1个肾小球的硬化区域为1%～25%，2级表示1个肾小球的硬化区域为26%～50%，3级表示1个肾小球的硬化区域为51%～75%，4级表示1个肾小球的硬化区域为76%～100%。

肾小管间质评分：根据光镜明确肾小管和肾间质病变程度（每张切片肾小球＞10个），肾小管急性病变以上皮细胞变性、坏死、细胞脱落作为评判标准，肾小管和肾间质慢性病变以肾小管萎缩和肾间质纤维化的面积作为评判标准，进行半定量分析。全部肾活检组织内病变面积＜25%为0分，≥25%、＜50%为1分，≥50%、＜75%为2分，≥75%为3分。

表2 各组大鼠干预后血生化指标比较

表1 各组大鼠各时期24 h尿蛋白定量比较（±s） 单位：mg

表1 各组大鼠各时期24 h尿蛋白定量比较（±s） 单位：mg

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组同时期比较，#P＜0.05；与本组造模第0周比较，△△P＜0.01。

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2.3.4 足突超微结构 采用透射电镜观察足突超微结构。选取约1 mm×1 mm大鼠肾脏皮质组织块，2.5%戊二醛4 ℃固定，1%四氧化锇酸后固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂与丙酮包埋，聚合成块，超薄切片（50～70 nm）后醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄片。计算足突融合率：首先测量基底膜总长度，设为A，然后测量基底膜足突融合的总长度，设为B，A/B的百分率即为足突融合率。

2.4 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件分析数据。计数资料用χ2检验，等级资料用秩和检验。非重复测量的计量资料，若符合正态分布，以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；若不符合正态分布，采用秩和检验。重复测量的计量资料，若符合正态分布，用重复测量方差分析；若不符合正态分布，将原始变量转换为秩次后，用秩次变量作重复变量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠各时期24 h尿蛋白定量比较 实验前（造模第0周）各组大鼠24 h尿蛋白定量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；造模各时期组内及组间比较见表1。

3.2 各组大鼠干预后血生化指标比较 见表2。

3.3 各组大鼠肾脏组织病理变化

3.3.1 光镜下各组大鼠肾小球、系膜区、肾小管间质病理情况比较 正常组：肾小球毛细血管襻开放良好，系膜细胞与系膜基质未见增生，基底膜无增厚；肾小管及间质无明显病理改变。模型组：肾小球光镜下出现节段硬化或球囊粘连，节段性毛细血管闭塞或血管外泡沫细胞浸润，系膜区未见明显增生；肾小管上皮细胞扁平甚至脱落；肾间质胶原纤维增生。治疗组：病理变化与模型组相似，但病变程度有所减轻。见图1。

3.3.2 电镜下各组大鼠肾小球足细胞变化比较 正常组：肾小球足细胞足突排列规整。模型组：肾小球足细胞足突融合，裂孔间隙消失，可见基底膜裸露，可见凋亡足细胞、空泡样变性足细胞。治疗组：病理变化与模型组相似，但病变程度有所减轻。见图2。

3.3.3 各组大鼠肾小球硬化指数、肾小管间质评分和足突融合率比较 见表3。

4 讨论

4.1 局灶节段硬化性肾病大鼠模型 模型组大鼠24 h尿蛋白水平较正常组明显升高，并且在第2周达到高峰，后期蛋白尿逐渐减少，可能与肾入球动脉硬化、肾小管萎缩、肾小球纤维化，导致蛋白尿、血肌酐等体内的代谢物较难排出体外有关。模型组大鼠血白蛋白下降、肾功能和血脂指标明显上升，且肾小球光镜下出现明显节段硬化，肾小管上皮细胞扁平甚至脱落，肾间质胶原纤维增生，电镜下肾小球足细胞足突广泛融合成片状，可见凋亡足细胞、空泡样变性足细胞。因此，我们认为本研究所使用的造模方法可获得较好的FSGS模型。

4.2 麻黄附子细辛汤的干预效果及意义 本研究结果显示，麻黄附子细辛汤作用于FSGS模型大鼠时，不但没有加剧肾功能损伤，反而使大鼠24 h尿蛋白定量好转，肾小球硬化指数降低，肾小管间质评分好转，足突融合率减轻，说明麻黄附子细辛汤可有效延缓FSGS进展。同时，本研究亦发现麻黄附子细辛汤可改善大鼠因FSGS引起的脂质代谢紊乱。药理学研究表明麻黄附子细辛汤具有抗炎、免疫调节等作用，其作用可能与激素相似[9]。本研究对临床上麻黄附子细辛汤用于FSGS及因此引发的脂质代谢紊乱的治疗具有重要指导意义。

4.3 “有故无殒”理论对中药毒性研究的指导意义 “有故无殒”理论始见于《素问·六元正纪大论》，原意为孕妇在患有大积大聚之病时，只要辨证论治准确，适度使用性味峻烈的药物既可祛除疾病，又不会伤害母体及胎儿，但是用药要适度。《内经》“有故无殒”理论告诉我们，当人体有病（即“有故”）时，疾病承担药物的治疗作用（药性），不会损伤人体（即“无殒”）。麻黄附子细辛汤中单味药附子（含乌头碱）、细辛（含马兜铃酸）的肾毒性研究有较多报道[10-16]。但是这类药物的肾毒性研究多以正常生理状态动物作为实验对象，忽略了“中药应该在中医理论指导下使用”这一基本原则[17]。而且中药讲究的是复方配伍，方剂配伍是中药临床增加疗效、减少毒性的重要方法。曹兰秀等[18]研究发现附子细辛配伍，附子可有效降低细辛的毒性。本研究结果为“有毒”中药及“含有毒中药”的组方在“有故无殒”理论指导下的临床安全应用提供了实验依据。

图1 各组大鼠肾脏组织病理变化（Masson染色，×200）

图2 各组大鼠肾脏组织电镜下足突细胞变化（醋酸铀-柠檬酸铅染色，×6 000）

表3 各组大鼠干预后肾小球硬化指数、肾小管间质评分和足突融合率比较

4.4 辛温法治疗慢性肾炎的探讨 辛温方麻黄附子细辛汤始见于《伤寒论》。根据性味及归经，此方具有开宣肺气、通调水道、调畅三焦气机、祛风通络、疏通津液、生复阳气、运化浊饮等功效。“阳化气，阴成形”出自《素问·阴阳应象大论》，张景岳注解道：“阳动而散，故化气；阴静而凝，故成形。”

笔者认为，有形之邪，本乃体内精微物质，因外邪侵袭、脉络不通、阳气不运，导致原本循经运行于脉内的精微物质被迫行于脉外而成有形之邪。对于慢性肾炎而言，“有形之邪”就是原本的精微物质（水液、血液、蛋白等）不能循经运行于脉内，被迫溢于脉外，而成水肿、血尿、蛋白尿、高脂、足突融合等病理产物。此时可予“辛通温化法”论治，以达到“宣散表邪，少火生气，以气化形，疏通脉络，使浊阴排出体外，精微物质复循行于脉内，输布润泽全身”的目的，在治疗时需注意中病即止。此观点也在本实验中得到了有效论证。

本研究虽然得到预期效果，但未对不同剂量的中药进行研究。在今后的课题研究中，我们将设置小剂量、正常剂量、中毒剂量甚至更多的剂量组，使其更具有说服力。