羊栖菜多糖对3T3-L1前脂肪细胞分化及其相关基因表达的影响※

●杨旭东 石 杰 杨骄霞 王桂云 宋高臣 张 杰▲

脂肪细胞是人体中重要的能量储存库，现代研究表明，脂肪细胞的数目增加、过度分化及代谢紊乱，与糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病密切相关[1]。因此，如何控制脂肪细胞生长和分化已成为治疗相关疾病的作用研究靶点。羊栖菜是一种食用海藻，隶属于褐藻门、马尾藻科、马尾藻属。羊栖菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）从海藻羊栖菜中提取，研究发现其具有降血脂、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、增强免疫力等生物活性[2-4]，本课题组前期的实验研究发现，SFPS 具有降低糖尿病大鼠血脂、改善胰岛素抵抗等作用[5-6]，但SFPS 对脂肪细胞的增殖分化的影响及其机制未见报道。本研究观察SFPS对3T3-L1 前脂肪细胞是否具有抑制增殖分化的作用，并研究其对相关基因表达的影响。

1 材料

1.1 材料与试剂前脂肪细胞3T3-L1 购自美国ATCC公司（批号：62996847）；DMEM高糖培养液购自美国Gibco 公司（批号：1782825）；Trizol 购自美国Gibco 公司（批号：15596-026）；MTT 购自索莱宝有限公司（批号：303H0524）；胰蛋白酶购自上海生工（批号：825J041）；PPARγ 抗体购自英国Abcam 公司（批号：ab24509）；FAS 抗体购自美国CST 公司（批号：31080T）；β-actin 抗体购自美国CST 公司（批号：4970T）；HRP 标记IgG 二抗购自英国Abcam 公司（批号：ab45966）；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器和设备RCO-3000T-5V CO2恒温培养箱（美国G.S.公司）；7500 ABI 荧光定量PCR（美国Bio-Rad公司）；UV-5200PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；Elx808酶标仪（美国Biotek 公司）；DYJ-909 倒置显微镜（上海点应光学仪器有限公司）；Universal HoodII凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 SFPS 的制备经200 目粉碎的干燥羊栖菜，先用水煮醇沉法提取[7-8]，经3次水煮，3倍体积的95%乙醇沉淀，得到羊栖菜粗多糖（深褐色），然后用Sevag法去除羊栖菜粗多糖中的蛋白成分得到初步纯化的多糖，通过SephadexG200凝胶柱用双蒸水洗脱分离纯化SFPS。用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，以葡萄糖为标准品，测得羊栖菜粗多糖中多糖含量为55.13%。

2.2 细胞培养根据参考文献[9]，3T3-L1 细胞培养于DMEM高糖培养基（10%新生牛血清、100mg/L链霉素、100IU/L青霉素），5%CO2培养箱，37℃培养。

2.3 MTT 检测3T3-L1 前脂肪细胞相对增殖率3T3-L1 前脂肪细胞中选取对数生长期的，以1×104/mL 的细胞浓度，接种于96 孔板，培养12h 后，将细胞分为对照组（Control Group）、SFPS 100 mg/L 组（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 组（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 组（SFPS 400mg/L Group），每个剂量设6 个平行孔。继续培养24h、48h、72h 后，每孔加入20μL MTT（5g/L）（调零组除外），4h后，弃去上清，加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡15min，结晶物完全溶解。酶标仪于570nm处比色，测定各孔光密度（OD）值。根据OD 计算细胞相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR），按下列公式计算RGR。RGR＝实验组OD值／对照组OD值×100%。

2.4 3T3-L1 细胞内总脂质及细胞分化抑制率的测定3T3-L1 前脂肪细胞以1×104/mL 的细胞浓度，接种于96 孔板，将细胞分为对照组（Control Group）、SFPS 100 mg/L 组（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 组（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 组（SFPS 400 mg/L Group），每个剂量设6 个平行孔。待细胞生长融合后48h（开始诱导分化，诱导分化第0天），含10%胎牛血清的DMEM 培养液中加入胰岛素（10μg/mL）、IBMX（0.5mmol/L）、地塞米松（1mmol/mL）诱导分化培养2d。弃上清，然后用加入胰岛素（10mg/L）的DMEM 培养液继续培养2d。更换DMEM培养液，继续培养9d，细胞分化基本完成，细胞胞浆中充满脂滴，形状接近圆形。另未分化细胞组（Undifferentiated cell group，UD Group）培养于DMEM高糖培养基（10%FBS），5%CO2培养箱，37℃培养，隔天换液，继续培养9d。在分化第9d，细胞用多聚甲醛（4%）固定30min，加入油红O∶去离子水=3∶2的染料，染色60min，PBS 清洗2 次，显微镜下观察细胞内有红染的脂滴，细胞分化成熟。加入异丁醇250μL，反复吹打振荡5min，溶解油红O 染料，吸取150μL 染料溶解液，酶标仪于510nm，测定各组OD 值，半定量脂肪细胞中总脂质含量并计算细胞分化抑制率。细胞分化抑制率（%）=（OD 对照组-OD 药物组）/OD 对照组×100%。

2.5 SFPS 对3T3-L1 细胞TG 的影响在分化第9d，收集分化成熟的细胞后，用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清，按照TG 测定试剂盒说明操作，测定TG含量。于500nm 处测定吸光度值，吸光度值与TG 浓度呈正比，TG单位为mmol/L。

2.6 SFPS对3T3-L1细胞中PPARγ、FAS蛋白表达的影响按照上述方法诱导3T3-L1 前脂肪细胞分化，在诱导分化开始，加入不同浓度的SFPS，每个剂量设6 个平行孔。在分化第9d，收集分化成熟的细胞，测定PPARγ、FAS 蛋白表达量。裂解细胞提取蛋白：加入100μL细胞裂解液，冰上裂解细胞10min，用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA 法定量。电泳：每组取40μg 蛋白，加样于10%SDS-PAGE 中电泳分离。转膜封闭：电泳结束后，湿式转膜法280mA 70min 转移蛋白至PVDF 膜，5%脱脂奶封闭液，室温封闭2h。特定蛋白测定：分别加入对应的一抗，4℃孵育12h；TBST 洗膜10min×3 次，加入相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育2h 后，弃去二抗；TBST 洗膜10min×3 次，加入显影剂ECL200mL，定影。用凝胶成像系统进行灰度值分析。

2.7 统计学分析统计学处理采用SPSS 18.0 软件，实验数据以（）表示，组间差异比较采用ANOVA检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞相对增殖率的影响不同浓度的SFPS 处理3T3-L1 前脂肪细胞24h、48h后，与对照组比较，各剂量组的细胞相对增殖率无统计学差异(P＞0.05)；而在72h 后，与对照组比较，400 mg/L 组的细胞相对增殖率显著下降(P＜0.05)。表明SFPS 在100～400 mg/L 的剂量范围内，培养72h，对3T3-L1的增殖有抑制，但抑制作用不显著。见表1。

3.2 SFPS对3T3-L1细胞总脂质及分化抑制率的影响与对照组比较，不同浓度SFPS作用后，分化成熟的脂肪细胞中总脂质含量显著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L组降低最明显，说明SFPS在脂肪细胞分化过程中能够减少细胞中总脂质含量。并通过测定的OD值，计算出脂肪细胞分化抑制率，SFPS 100 mg/L 组、SFPS 200 mg/L组和SFPS 400 mg/L组的细胞分化抑制率分别为14.51%、21.82%、44.11%。说明不同浓度SFPS 均可抑制脂肪细胞的分化（P＜0.01），SFPS 400 mg/L组抑制效果最显著（P＜0.01）。见图1。

表1 SFPS对3T3-L1前脂肪细胞相对增殖率的影响（，n=6）

表1 SFPS对3T3-L1前脂肪细胞相对增殖率的影响（，n=6）

注：与对照组比较，*P＜0.05

3.3 SFPS 对3T3-L1 细胞中TG 含量的影响与对照组比较，不同浓度SFPS作用后，分化成熟的脂肪细胞中TG含量显著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L组TG含量降低最明显，说明SFPS 在脂肪细胞分化过程中能够减少细胞中TG含量。见图2。

3.4 SFPS对3T3-L1细胞中PPARγ、FAS蛋白表达的影响与对照组比较，SFPS 各剂量组PPARγ、FAS蛋白表达量均显著降低（P＜0.01），且PPARγ、FAS 蛋白表达量随着SFPS 浓度的增高而逐渐降低。说明SFPS 在脂肪细胞分化过程中，能够通过影响细胞中PPARγ、FAS 蛋白表达量来抑制3T3-L1 细胞分化。见图3。

图1 SFPS对3T3-L1细胞中脂质含量的影响

图2 SFPS对3T3-L1细胞甘油三酯含量的影响

图3 SFPS对3T3-L1细胞中PPAR-γ、FAS蛋白表达的影响

4 讨论

SFPS 是从褐藻门食用海藻羊栖菜中提取的多糖成分，主要包括褐藻淀粉、褐藻糖胶和褐藻酸。SFPS已被证实在脂代谢中具有降血脂、抑制脂质沉积和保护脂肪变的肝细胞等作用[10-11]，本课题组前期的实验研究也进一步验证了其在脂代谢中的作用。肥胖、脂肪细胞的过度增殖分化及代谢紊乱与多种疾病相关[12]，因此，本实验进一步研究SFPS对3T3-L1前脂肪细胞分化是否具有抑制作用，并初步探讨其作用机制。

前脂肪细胞要经过融合前增殖、接触抑制、克隆扩增、扩增停止四个阶段分化为成熟的脂肪细胞[13]，此过程中需要多种转录因子诱导细胞转化，促进脂滴形成。PPARγ属于核内受体转录因子超家族，是众多脂肪分化因子中最关键的，可直接调控脂肪细胞分化，参与脂的代谢[14-15]，PPARγ与生理性或药理性配体结合后，改变构象，结合相关DNA上的PPARγ反应元件，从而调节相关基因的转录。PPARγ是脂肪细胞分化过程中必须的转录因子，可进一步调控脂代谢的相关酶的表达。为了研究SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞分化的影响，诱导分化开始，加入不同浓度的SFPS。实验结果显示，在分化第9d，不同浓度的SFPS各组细胞中PPAR-γ蛋白的表达量显著减少。

FAS 是脂肪酸合成的关键酶[16]，以乙酰辅酶A 为原料催化生成长链脂肪酸，并进一步形成甘油三酯储存于细胞中。实验研究表明，脂肪组织中FAS 的mRNA 表达量与肥胖是正相关的，抑制FAS的量可以减少脂滴的生成[17-18]。PPARγ是前脂肪细胞分化关键的转录因子，而FAS 出现在分化的中期、后期，属于PPARγ 下游靶基因之一，调节脂类的合成、储存。实验结果显示，在分化第9d，不同浓度的SFPS各组细胞中FAS 蛋白的表达量显著减少，表明SFPS 可通过降低FAS蛋白的表达，抑制3T3-L1中脂质的生成。

本研究结果显示：①SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化，减少脂肪细胞中总脂质及TG的含量，浓度越大，抑制作用越明显。②SFPS 可以明显下调3T3-L1细胞PPARγ蛋白的表达，降低FAS蛋白的表达。实验结果提示，SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化的分子机制可能与调控PPARγ和FAS蛋白的表达有关。