辛伐他汀通过AMPK/mTOR信号通路及氧化应激对鼻咽癌细胞凋亡和侵袭转移的作用研究

陈洪昌，廖 蕾，周光耀，张惠琴

（1.成都市新都区人民医院耳鼻咽喉科，四川 成都 610500；2.四川大学华西医院耳鼻喉头颈外科；3.贵州医科大学耳鼻喉头颈外科）

鼻咽癌临床常见，恶性程度高，治疗手段主要为手术及放化疗。但术后容易复发，预后差，严重威胁病患生命健康。虽然目前有新型化疗药物使用，但临床实际应用效果仍差，寻找有效的抗鼻咽癌药物，仍是鼻咽癌治疗的重要研究方向。

辛伐他汀（simvastatin，SIM）是一个经典的降血脂药物，近年来，多项研究显示，辛伐他汀能够降低病人肿瘤的发病率，甚至可以提高恶性肿瘤病人的生存率，进而引起研究者们广泛兴趣[1～3]。研究发现，辛伐他汀具有抗肿瘤细胞生物活性，在体内外均能抑制肿瘤细胞的生长，并且能够增强肿瘤放化疗的敏感性[4，5]。目前辛伐他汀已被用于多项癌症病人的临床治疗研究[6]。有研究发现，辛伐他汀能够抑制鼻咽癌细胞生长及促进凋亡，但是机制不明[5，7]。因此为观察辛伐他汀对鼻咽癌的抗肿瘤作用，本文的研究对象为人鼻咽癌CNE-2细胞，并通过临床药物辛伐他汀作用观察药物对鼻咽癌CNE-2细胞的生命周期影响状况。

AMPK/mTOR信号通路和氧化应激在肿瘤生长、代谢、凋亡过程等过程中作用关键，有报道显示，辛伐他汀通过调控AMPK/mTOR信号通路、氧化应激系统对肺癌、胰腺癌起诱导凋亡的作用。目前辛伐他汀抗肿瘤的研究多见于乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等等，关于辛伐他汀与鼻咽癌相关研究较少[8]，本研究进一步观察了辛伐他汀对鼻咽癌细胞的的作用及其与AMPK/mTOR信号通路和氧化应激的关系，为进一步临床研究和应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 CNE-2细胞培养及传代

本文所选用的试验材料为本单位保存的人鼻咽癌细胞CNE-2，细胞培养液主要组成成分为10%胎牛血清，去定量的人鼻咽癌细胞CNE-2并将其置于37℃，含5%CO2的恒温培养箱中进行培养，人鼻咽癌细胞CNE-2为单层贴壁生长。隔两天传代，试验中以对数生长期细胞进行处理。

1.2 主要仪器与试剂

辛伐他汀、DMSO、MTT等试剂和药物均采购于美国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测试剂盒采购于美国Invitrogen公司，Gallios流式细胞仪，Caspase-3检测试剂盒则采购于碧云天生物技术研究所，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于上海美季生物技术有限公司；SDS-聚丙烯酰胺、PBST溶液、GIS-2020D凝胶图像分析系统采购于Sigma公司；试验中所用的抗体如：bcl-2、bax、AMPK、pAMPK及mTOR等抗体均采购于美国Abcam公司。

1.3 MTT测细胞存活率

提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并在其中加入胰酶予以处理，随后完成计数和调整密度等工作，在孔板中进行接种，当CNE-2细胞贴壁后去除原培养液并向其中加入含药物的新培养液，试验用药物为辛伐他汀稀释液，实验分为4组，各组中辛伐他汀终浓度分别为0 mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/L，其中辛伐他汀0mmol/L为对照组，在细胞培养24h、48h、72h时添加，并向孔板中加入5mg/mL MTT每孔20μL，静置4h后弃上清液并向其中加入150μL的DMSO随后进行振荡，在波长为570nm的光源照射下测吸光度值。试验重复三次。

1.4 Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测

提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并将细胞浓度为5×104/mL的进行接种处理，采用不同浓度辛伐他汀对每组细胞作用相同时间，均为48h，并向其中按1×106/mL密度混入缓冲液重悬，根据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒测试指导说明完成相应的检测操作，加入5μlLAnnexin V-FITC，避光10min后在离心机中进行离心处理，弃上清，并加入缓冲液重悬，加入10μlLPI染色液充分混合后在温度为4℃的恒温箱中进行避光染色15min，处理完成后在0.5h内完成检测。试验重复三次。

1.5 Transwell实验测细胞侵袭迁移能力

CNE-2细胞接种于24孔板，调整细胞浓度为2×105/mL，加入药物处理48h后，在Transwell小室上、下室之间的微孔膜上铺上Matrigel溶液50μL，并置于温度为37℃恒温箱中完成聚合，聚合时间为30min。随后将不同实验组细胞进行洗涤和消化。在完成细胞收集后分别置于培养箱中培养1d，向每组中加入0.5%结晶紫染液并完成室温孵育10min。去基质胶和上室内细胞，观察并统计穿过滤膜的细胞个数，随机选取5个视野计数均值。迁移能力测定则transwell小室上室无需采用Matrigel溶液包被，其余步骤同前。

1.6 Western blot方法检测辛伐他汀对人鼻咽癌细胞CNE-2的BAX、BCL-2、AMPK、pAMPK、mTOR等相关蛋白的表达影响

提取本单位培养的对数生长期CNE-2细胞并将浓度为5×104/mL的细胞接种于培养皿中，采用药物作用细胞48h，向其中加入胰酶完成消化收集，将收集的细胞作为观察组并取与收集细胞等量的蛋白质进行12%SDS-PAGE凝胶电泳处理，并转入PVDF膜向其中加入5%脱脂奶粉，随后置于恒温4℃保温箱中过夜，将封闭过夜的细胞稀释于0.5%BSA液中，在印迹膜室温孵育2h并取出，利用TBST洗膜10min×3次，然后用0.5%BSA液稀释的二抗与印迹膜在室温孵育2h加入TBST液洗膜15min×3次，通过凝胶成像仪进行成像观察分析。

1.7 辛伐他汀对CNE-2鼻咽癌细胞中丙二醛量（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

取对数生长期细胞CNE-2，用0.5%的胰蛋白酶消化，并以培养液调整成1×105/mL的单细胞悬液。按2mL／孔接种单细胞悬液于6孔细胞培养板，置37℃培养箱中培养48 h。然后换含有辛伐他汀的培养液，浓度同前，培养48h后收集细胞，采用超声波破碎（功率300w，破碎25s，间歇25s）。离心收集上清，选用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别对MDA和SOD进行检测，蛋白含量采用brandford法进行测定。

1.9 统计分析

上述试验所得数据通过Mean±SD予以表示，并采用SPSS17.0软件完成统计学检测，服从正态分布的数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中Tukey's法完成比较，以P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有高度统计学意义。

2 结果

2.1 MTT测辛伐他汀对CNE-2细胞存活率的影响

以对照组存活率作为100%，辛伐他汀0.1mmol/L作用24h、48h、72h人鼻咽癌CNE-2细胞存活率分别为88.3%±3.72%、82.4%±4.59%、78.3%±5.29%。辛伐他汀1mmol/L作用24h、48h、72h存活率分别为80.8%±5.14%、73.7%±4.98%、60.8%±6.38%。辛伐他汀10mmol/L作用24h、48h、72h存活率分别为66.3%±4.85%、57.3%±5.24%、45.7%±7.26%。使用辛伐他汀处理后，CNE-2的细胞存活率显著下降，且细胞存活率对照组>辛伐他汀0.1mmol/L>1mmol/L>10mmol/L，辛伐他汀各组细胞存活率24h>48h>72h，说明辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞具有一定抑制功能，且药物浓度和作用时间同抑制人鼻咽癌CNE-2细胞增值效果呈现正相关关系。其中，辛伐他汀浓度为0.1mmol/L作用24h及48h与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），其余各组与对照组相比均具有显著统计学意义（P<0.01）（见图1）。

2.2 Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测辛伐他汀对CNE-2细胞凋亡率的影响

对照组细胞凋亡率2.5%±0.5%，药物浓度分别为0.1、1、10mmol/L时凋亡率分别为6.1%±1.3%、24.3%±3.9%、44.1%±4.8%，结果表明辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞具有抑制增值和诱导细胞凋亡的作用，且诱导效果同药物浓度与作用时间呈正相关关系。辛伐他汀各组凋亡率与对照组相比具有统计学差异（P<0.05）（见图2，3）。

2.3 辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞侵袭转移的影响

随着辛伐他汀药物浓度不断升高，鼻咽癌CNE-2细胞迁移细胞数和侵袭细胞数也明显减少，均少于对照组。辛伐他汀0.1mmol/L与对照组相比具有统计学差异（P<0.05）；辛伐他汀1、10 mmol/L与对照组相比具有显著统计学差异（P<0.01）。此结果提示辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞的侵袭和转移具有抑制作用（见图4）。

2.4 辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞AMPK/pAMPK/mTOR/BAX/Bcl-2蛋白表达的影响

AMPK是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是胆固醇合成和脂肪代谢关键酶的上游调节因子，在能量代谢中起着非常重要的调控作用，又被称为“能量传感器”[18]。辛伐他汀对CNE-2细胞蛋白表达的影响程度为：CNE-2细胞在药物浓度分别为0、0.1、1、10mmol/L的条件下，AMPK/pAMPK/BAX 和mTOR/Bcl-2表达分别随药物浓度增高而逐渐上升和下降，观察组和对照组的比较差异具有统计学意义（见图5）。

2.5 辛伐他汀对人鼻咽癌CNE-2细胞MDA含量及SOD活力的影响

鼻咽癌CNE-2细胞MDA含量随着辛伐他汀浓度升高而升高，SOD活力随着辛伐他汀浓度升高而下降，其中，辛伐他汀浓度为0.1mmol/L与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），辛伐他汀浓度为1、10mmol/L与对照组相比均具有显著统计学意义（P<0.01）（见图6）。

3 讨论

鼻咽癌是临床常见头部恶性肿瘤，发病率逐年增长，病人家庭和社会负担沉重。目前，鼻咽癌治疗多为手术、化疗、放疗及分子靶向治疗模式，但五年生存率低，治疗效果欠佳[9]。临床鼻咽癌病人的治疗迫切需要寻找有效的抗鼻咽癌药物。

辛伐他汀（simvastatin，SIM）是一个经典的降血脂药物，近年来，多项研究显示，辛伐他汀能够降低病人肿瘤的发病率，甚至可以提高恶性肿瘤病人的生存率，进而引起研究者们广泛兴趣，成为研究热点[9，10]。研究发现该药物在临床治疗鼻咽癌具有抑制肿瘤细胞生长的作用，目前辛伐他汀已被用于多项癌症病人的临床治疗研究[11]。

BAX和BCL-2是BCL-2基因家族中常见的促进细胞凋亡的蛋白质，对于控制肿瘤细胞凋亡具有重要作用。本研究显示，同对照组相对，观察组采用辛伐他汀（0.1、1、10mmol/L）作用于鼻咽癌CNE-2细胞后细胞存活率显著下降，凋亡率升高（P<0.05），且试验效果具有剂量-反应关系，不仅如此该药物作用后还能增强Caspase-3的活性，促使BAX蛋白过量表达，并抑制Bcl-2蛋白表达水平，试验结果表明辛伐他汀可用于临床治疗鼻咽癌，与其他报道相符[12]。

AMPK/mTOR信号通路在细胞增殖、存活、凋亡、糖代谢、基因转录和细胞迁移中扮演了重要的角色，AMPK作为一种抑癌基因蛋白，是目前肿瘤研究的靶点之一，激活AMPK能够抑制mTOR的磷酸化，发挥抗肿瘤效应，能够影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等多种生物学行为[13]。研究显示，辛伐他汀能够作用于AMPK/mTOR途径进而起到抗胶质瘤、卵巢癌、肝癌等肿瘤作用。本研究显示，辛伐他汀能够使得AMPK及pAMPK蛋白表达增加，mTOR蛋白表达水平降低，观察组和对照组试验结果差异具有统计学意义（P<0.05），说明辛伐他汀对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制增殖、诱导凋亡的作用可能与AMPK/mTOR通路有关。

丙二醛（MDA）反映氧自由基对组织细胞的损害程度，超氧化物歧化酶（SOD）能够清除氧自由基，两者是氧化应激系统的标记性物质。本研究结果表明，辛伐他汀能够增加MDA含量，减少SOD活性，由此可见辛伐他汀抗鼻咽癌作用可能与氧化应激有关。综上所述，辛伐他汀对鼻咽癌细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡和抑制侵袭转移的作用，可能与AMPK/mTOR 通路和氧化应激有关。本研究为鼻咽癌的治疗提供新的思路，还有待进一步深入研究和探讨