pH响应的铜-大黄素脂质体的制备及其体外释放研究

陈 静

（南京中医药大学翰林学院，江苏泰州225300）

0 引言

大黄素（Emodin，EM）是一种蒽醌的衍生物，是大黄的有效成分之一。大黄素的药理作用广泛，研究发现其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及调节胃肠功能的作用，同时还具有止咳、利尿等作用，且也能够改善心血管系统。但由于其水溶性差、生物利用度低等问题，限制了其在临床上的广泛运用［1-3］。pH 响应型的递药系统是根据肿瘤部位的酸性环境而设计的。利用大黄素的富电子基团与外层缺点子的金属离子形成配位共价键，当环境呈现酸性时，氢质子与金属离子竞争，使得大黄素-金属离子配位键断裂，从而实现大黄素的药物释放［4］。这种大黄素-金属离子的配位键，不仅连接了药物，实现药物的稳定递送，同时使得药物的释放具有环境响应性，从而降低了药物在肿瘤治疗过程的毒副作用，实现靶向给药。

1 材料与仪器

1.1 材料

大黄素（纯度≥98.5%，上海源叶生物科技有限公司），大豆磷脂（上海胎位药业有限公司），胆固醇（国药集团化学试剂有限公司），乙酸铜（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

RE-2000A 型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器责任有限公司；Waters 2695 高效液相色谱仪，美国Waters公司；Hedera ODS-2 色谱柱，江苏汉邦科技有限公司；CL21 R 型高速离心机，德国ThermoFisher 公司；HY-45气浴恒温生物摇床，江苏金坛市金城国盛实验仪器厂。

2 方法与结果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 色谱条件

采用HPLC-UV 测定大黄素。色谱柱为Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水（70∶30）；流速为1 mL/min；检测波长为437 nm，进样量10 μm；柱温为30 ℃。

2.1.2 线性关系考察

精密称取大黄素原料药9.92 mg 于100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配置成99.20 μg/mL的大黄素标准溶液。精密吸取标准溶液，用流动相进行稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定。以大黄素峰面积（A）为纵坐标、浓度（C，μg/mL）为横坐标进行线性回归。在0.20～59.52 μg/mL 内的线性关系良好，标准曲线为y=63 660x+1 571.9，r=0.999 9。

2.1.3 精密度试验

取标准溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，考察仪器精密度。根据峰面积结果计算大黄素浓度，并计算出大黄素精密度RSD 为1.32%，说明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验

取铜-大黄素脂质体100 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸调pH 至酸性，涡旋30 s，适量甲醇稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，平行操作6 次。根据峰面积结果，计算大黄素的含量，并计算出大黄素重复性RSD为1.75%，说明此处理方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验

取铜-大黄素脂质体150 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸调pH 至酸性，涡旋30 s，适量甲醇稀释，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24 h 进样。根据峰面积结果，计算24 h 内大黄素含量变化，并计算出大黄素稳定性RSD为2.17%，说明大黄素在供试品溶液中稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验

精密吸取6 份已知含量的铜-大黄素脂质体100 μL，加入已知含量的标准品50 μL，加甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸调pH至酸性，涡旋30 s，按“2.1.1”项下色谱条件进样，加样回收率试验结果如表1 所示，大黄素平均回收率为98.42%，RSD为1.48%。

2.2 铜-大黄素脂质体的制备

称取大黄素50 mg（0.185 mol）于250 mL锥形瓶，60 mL乙醇溶解，逐滴加入等物质的量的乙酸铜乙醇溶液，以氢氧化钠调节pH 8～9，60 ℃搅拌12 h，有褐色沉淀生成。反应液抽滤，依次用无水乙醇和乙醚洗涤，得铜-大黄素配合物。称取大豆磷脂100 mg，胆固醇10 mg，溶于30 mL 乙醇中，将5 mg 铜-大黄素配合物分散于少量的二甲亚砜中，转移至250 mL 梨形瓶，超声使溶解完全，40 ℃减压蒸发2 h，得均匀薄膜，真空干燥过夜。用10 mL蒸馏水水合10 min，取水合后溶液于西林瓶，冰浴，探头超声10 min，超声条件：300 W，持续超声2 s，停1 s，即得铜-大黄素脂质体。

2.3 包封率测定

由于铜-大黄素配合物在水中的溶解度很低，故采用膜过滤法测定脂质体包封率。取制备好的铜-大黄素脂质体，过0.45 μm 滤膜，分别取过膜前后的脂质体100 μL，加入850 μL甲醇破乳，加入50 μL 2%磷酸调pH 至酸性，涡旋30 s，适量甲醇稀释，按“2.1.1” 项下色谱条件进行测定，计算大黄素含量。

包封率（EE，%）=过膜后大黄素含量/大黄素投药量×100%

2.4 体外释放研究

2.4.1 缓冲溶液的配制

pH 4.5缓冲溶液的配制：精密称取醋酸钠18.00 g，加蒸馏水溶解，加入冰醋酸9.8 mL，混合均匀，定容至1 000 mL，即得。

pH 6.5 缓冲溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾6.80 g，加水蒸馏水溶解，加入152 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，混合均匀，定容至1 000 mL，即得。

pH 7.4 缓冲溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾1.36 g，加蒸馏水溶解，加入79 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，混合均匀，定容至200 mL，即得。

2.4.2 体外释放

为研究铜-大黄素脂质体中大黄素的体外释放行为，选择不同pH 释放介质进行考察。以pH 4.5 缓冲体系模拟肿瘤细胞内涵体/溶酶体（pH 4.0～6.0）环境，以pH 6.5 缓冲体系模拟肿瘤间隙（pH 6.5～7.2）环境，以pH 7.4缓冲体系模拟血液（pH 7.4）环境［5］。精密吸取铜-大黄素脂质体、大黄素混悬液，加入预处理过的3 500 Da分子量的透析袋中，置于50 mL不同pH的缓冲液中，37 ℃恒温空气浴摇床，不断震荡。分别于0，5，15，30，45 min及1，2，4，8，12，24，36 h取样5 mL，并补足新鲜介质。

表1 脂质体中大黄素的加样回收率

将不同释放介质中取出的样品过0.45 μm滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件进行检测。以时间为横坐标、累计释放度为纵坐标，绘制累计释放度曲线，如图1所示。

图1 铜-大黄素脂质体在不同pH环境中的释放（n=3）

从图中可以看出，由于大黄素水溶性差，大黄素混悬液36 h累积释放度只有8.12%。对于铜-大黄素脂质体，在pH 4.5 条件下，大黄素的累积释放度达89.52%，显著高于pH 6.5（41.03%）和pH 7.4（30.77%），表明在血浆中铜-大黄素脂质体能保持较稳定的状态，而在到达肿瘤部位时，在肿瘤细胞内涵体/溶酶体（pH 4.0～6.0）环境下释放药物，实现pH响应性释放。

3 讨论

本文建立了大黄素的HPLC测定方法，实验表明该方法专属性好，精密度高，回收率符合要求。以薄膜分散法制备铜-大黄素脂质体，包封率达75.68%，粒径为183.46 nm。为验证铜-大黄素脂质体的pH响应性，以不同pH得缓冲体系模拟血浆、肿瘤细胞间隙和肿瘤细胞内涵体/溶酶体环境，结果发现，铜-大黄素脂质体在酸性环境中的释放量明显增加，具有pH响应性，为实现肿瘤的靶向治疗奠定基础。