基于网络药理学研究核桃改善记忆的功能

吕泓霖，许成梅，陈 丹，马雅鸽，陈朝银，赵声兰

（1. 云南中医药大学，昆明 650500；2. 云南省烟草监测站，昆明 650106；3. 云南经济管理学院，昆明 650106）

学习和记忆是脑的重要机能之一，改善和延缓学习记忆能力减退是人类追求强大和健康的方向和手段之一[1]。记忆力减退的产生是外界因素影响与人体功能紊乱交互作用所致，现代社会饮食结构变化，精神压力增大，使脑代谢紊乱，导致记忆力下降。同时随着人口老龄化，老年人口比例增加，我国60岁以上的人口中，有70%～80%伴有不同程度的健忘和老年痴呆。目前临床上药物对老年痴呆导致的学习记忆障碍的治疗效果不理想[2]，因此，早期预防和干预老年痴呆是目前研究的重点之一[3-4]。

核桃又名胡桃、羌桃，系胡桃科 （Juglandaceae）的核桃属（JuglanLinn.）、山核桃属（Carya）、缘核桃属（Annamocarya） 等果木兼用植物[5]。我国核桃种植面积和产量均居世界第一，有丰富的核桃资源[6]。核桃仁含油脂58.8%，富含w–6和w–3脂肪酸以及神经酸、鳕油酸、角鲨烯、植物固醇、多酚等功能性成分[7]。其中核桃多酚往往随加工副产物被废弃，造成资源浪费，核桃多酚类化合物主要是酚酸和单宁类，以及少量的黄酮类化合物。核桃被历代医家称为药食同源的健脑益智佳品[8]，本文基于网络药理学和分子对接技术研究核桃改善学习记忆的物质基础和潜在作用机制[9]，为云南丰富核桃资源的利用提供新思路，也为核桃改善记忆的产品开发和利用提供理论依据。

网络药理学打破了药物–单一靶标的研究方式，通过进行多层次网络构建，得到药物–靶点–疾病复杂的网络关系，从整体探索中药多成分与靶点的作用关系。其中中药系统药理学分析平台（TCMSP）包含中国药典中的499种中药，共29 384种成分，3 311种靶点，837种相关疾病。Geencard是人类基因综合数据库，包含基因组、蛋白组、转录、遗传和功能上的基因。OMIM提供已知遗传疾病的相关基因信息。STRING是搜索已知蛋白相互关系的数据库，是覆盖物种最多，相互作用信息最全的。DAVID是一个生物信息数据库，其整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表（成百上千个基因ID或者蛋白ID列表）提供系统综合的生物功能注释信息。CB-Dock分子对接在线平台的特点是可以预测给定蛋白质的结合位点[10-11]。

1 数据来源及分析方法

1.1 核桃活性成分及作用靶点的收集

采用中药系统药理学分析平台（TCMSP），输入关键词“Walnut”检索，口服生物利用度是药物筛选的关键参数[12]，根据口服生物利用度（OB）≥15%进行筛选[13]，得到核桃的主要化学成分，并匹配相应的作用靶点。

1.2 记忆靶点的收集

采用综合性人类基因数据库（Geencard）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM）输入“memory”为关键词，以评分≥5筛选记忆相关的靶点[14]，删除重复的靶点，得到改善记忆的关键靶点。

1.3 核桃化合物–靶点的网络构建

将核桃活性成分对应的靶点和记忆相关的靶点进行比较，获得二者共有的靶点[15]，然后使用Cytoscape3.7.1图形化网络分析和编辑的软件，进行“核桃活性化合物–记忆靶点”的网络构建。在网络中，节点表示核桃活性成分、记忆相关靶点。网络中的边用来连接药物与活性成分、活性成分与关键靶点，疾病与关键靶点。在网络中一个节点的度表示和节点相连的条数，度值越大说明这个节点越可能是关键节点[16]。

1.4 GO功能富集和KEGG信号通路分析

利用 DAVID数据库对核桃改善记忆的靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析[17]，以统计学超几何分布定量评估相关性，设置P<0.05，并将富集结果进行图表可视化[18]。

1.5 蛋白互做网络的构建

STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的数据库，为了阐述核桃改善记忆蛋白的相互作用关系，将 1.3得到核桃改善记忆靶点输入STRING数据库，物种选择“人”，该数据库可以对蛋白质的相互作用关系进行打分，分值越高表明相互作用的置信度高[19]，本文将相互作用评分设置为中置信度（0.400），得到核桃改善记忆蛋白的相互作用关系（PPI）。

1.6 分子对接验证

为了确定网络药理学预测核桃改善记忆靶点的准确性，采用分子对接进行验证。将蛋白互作网络中评分较高的蛋白与KEGG结果中靠前的通路进行比较分析，得到准备验证的关键靶点，将靶点输入 PDB数据库，选择最佳的蛋白晶体结构，并从 PubChem数据库中下载核桃化学成分3D结构式。将关键靶点的蛋白结构、核桃主要成分结构式导入到CB-Dock在线平台进行分子对接，预测潜在蛋白质的结合位点，并根据空腔大小排序选择几个得分最大的空腔，设置空腔的中心，调整空腔尺寸，之后用 AutoDock Vina程序进行分子对接[20-21]。

2 结果与分析

2.1 核桃活性成分及靶点筛选结果

从中药系统药理学分析平台（TCMSP）得到核桃化学成分共 20种（见表 1），其中口服生物利用率、血脑屏障透过率、成药性较好的有methyl- octadecanoate（十八碳酸甲酯）类等成分。生物利用度较低的如 Cornustannin 2（山茱萸鞣质），一般不宜口服给药，可注射给药；血脑屏障透过率较低的如pentagalloylglucose（五没食子酰葡糖）等可通过修饰和剂型选择加以提高；成药性较低的如 Casuarictin（木麻黄素）则可通过包埋、乳化等适当方法加以调整。

表1 核桃活性成分信息

2.2 记忆相关的靶点

采用人类基因疾病相关的数据库（Geencard）和孟德尔遗传数据库（OMIM），收集与记忆有关的靶点[22]，选择得分≥5的靶点[23]，得到 5 559个记忆相关的靶点。

2.3 药物–疾病靶点预测结果

将核桃活性成分的作用靶点与记忆相关靶点进行匹配，得到38个共有靶点，对应的核桃活性成分8个（见表2）。

构建“中药化合物–作用靶点”网络[24]，如图1，网络中共有48个节点，91条相互作用的边。通过 Cytoscape计算网络参数，得到核桃活性成分和靶点作用关系[25]，核桃中化学成分按节点度值排序由高到低依次是 ellagic acid（鞣花酸）、euprostin A、Pentagalloylglucose（没食子酰葡萄糖）、juglone（胡桃醌）、Juglanin（胡桃苷）、Methyl 9-cyclopropylnonanoate（9–环丙基壬酸甲酯）。这些化学成分是核桃改善记忆的物质基础。同时节点度值较高的靶点是 PTGS2（前列腺素环氧合酶）、PRKCB（蛋白激酶Cβ型）、PRKCA（蛋白激酶 Cα型）等，提示核桃改善记忆是多成分、多靶点共同作用。

表2 核桃活性成分的改善记忆的靶点

图1 核桃活性成分–记忆靶点网络图

2.4 核桃改善记忆靶点的GO功能分析

通过对核桃改善记忆的38个靶点进行GO富集分析，其中生物学功能富集排名靠前的有蛋白激酶C活性、抗氧化活性、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性、丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白的活性，以及核受体活性、转录因子活性、烟酰胺–腺嘌呤二核苷酸磷酸结合、血红素结合、类固醇激素受体活性（见表3），这些GO功能可能是核桃改善记忆的重要生物学过程。

2.5 核桃改善记忆靶点的通路分析

通过DAVID数据库，对核桃改善记忆的关键靶点进行 KEGG通路富集分析（P<0.05），筛选前20条记忆相关通路（见表4），主要涉及到IL–17信号通路、松弛素信号通路、血管平滑肌收缩、血管内皮生长因子信号通路、NF–κB信号通路、低氧诱导因子1信号通路、5–羟色胺能突触、鞘脂信号通路、内分泌和其他因素调节钙的重吸收、谷胱甘肽代谢、TNF信号通路等，提示核桃改善记忆的靶点分布在多条通路中，核桃改善记忆是多条通路相互作用的结果。

图2 核桃改善记忆靶蛋白互做（PPI）网络图

表3 核桃改善记忆靶点的GO功能富集

2.6 靶标蛋白互作网络构建

将核桃改善记忆的靶点输入到 String数据库进行分析，获得靶点蛋白相互作用关系网络图（见图2），共有 38个节点和164条相互作用连线，节点平均自由度为8.6。根据网络节点度排序，关键靶点蛋白依次为VEGFA（激素区的血管内皮生长因子A）、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）、CAT（抗氧化区的触酶）、MMP9 (基质金属蛋白酶9）、RELA（转录因子p65）、PRKCB（蛋白激酶C beta II）、PRKCA（蛋白激酶Cα 型）。

2.7 分子对接验证

蛋白互作网络（PPI）中评分较高的蛋白可以认为起到重要作用，将评分较高的潜在蛋白相对应的靶点与KEGG通路分析结果进行比较分析，将核桃改善记忆的潜在靶点 PRKCA（蛋白激酶Cα型）、PRKCB（蛋白激酶 Cβ型）作为分子对接的对象。导入 PDB数据库，得到 PRKCA、PRKCB分辨率较高的蛋白结构3iw4、2i0e。在“活性成分–记忆靶点”中选择度值较高的核桃活性成分：鞣花酸、没食子酰葡萄糖、胡桃醌作为对接分子，在CB-Dock在线平台进行对接，以Vina score得分来评价对接结果（见表5）。Vina是以相应的口袋参数对受体和配体进行分子对接所得到复合物的得分，这个值越低代表受体和配体亲和力越高，对接结果越好。结果发现筛选得到的活性成分与预测的靶点均有结合，其中鞣花酸（ellagic acid）、没食子酰葡萄糖（Pentagalloylglucose）均与PRKCA、PRKCB靶点有较强的亲和力（见图3）。

表4 核桃改善记忆靶点的KEGG通路

表5 核桃活性成分与靶点蛋白分子对接评分

图3 主要活性成分与靶点蛋白的分子对接

3 讨论

我国核桃种植面积和产量居全国第一，品种多样，资源丰富，一直以来是药食同源的健脑佳品。核桃可提高小鼠的学习记忆能力，可减缓D–gal模型小鼠的记忆障碍[26]。核桃改善学习记忆具有多成分、多靶点的特点，本文基于网络药理学进行分析，找到核桃改善记忆的物质基础和重要靶点。筛选得到8个核桃的活性成分，如鞣花酸、胡桃醌、没食子单宁等，对应38个核桃改善记忆的靶点，核桃活性成分通过协同作用与记忆相关的靶点，有前列腺素环氧合酶、蛋白激酶Cα型、蛋白激酶 Cδ和蛋白激酶 Cγ型等，其中前列腺素环氧合酶–2可以将花生四烯酸酯转化为前列腺素H2（PGH2），前列腺素可调节大鼠海马组织 VEGF、BDNF蛋白的表达，并可改善痴呆大鼠的记忆功能[27]，蛋白激酶C是丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族一员，是信号转导通路的中心分子之一，参与调节细胞增殖、分化等多种生物代谢的功能。其在中枢神经系统中起重要作用[28]，PRK是突触功能调节器，包括调节突触合成、囊泡充填及多种神经递质的释放。同时活化的PKC能增加海马乙酰胆碱的释放[29]。此外，PKC的活化还能增强乙酰胆碱转移酶活性，导致乙酰胆碱形成增多进而参与学习记忆的形成过程。这些核桃改善记忆的靶点涉及的生物学过程主要包括抗氧化过程的调节、蛋白激酶C的活性、配体激活的转录因子活性、核转录因子的活性等，这些生物学过程通过协同作用来改善记忆。

通过对改善记忆的靶点进行 KEGG通路富集，主要作用20条通路，如血管平滑肌收缩信号通路（调节靶点蛋白PRKCB、PRKCA等蛋白激酶家族的蛋白进行传导）、NF–κB 信号通路、5–羟色胺能突触、谷胱甘肽代谢等，其中MAPK信号通路（PRKCB、PRKCA等涉及到6个靶蛋白），MAPK是联系细胞膜受体与细胞内重要调节靶目标的进化保守的酶类，可以调节AD中的标志物Tua蛋白，防止其过度磷酸化[30]。前人研究发现Tua蛋白发生过度磷酸化是由于体内蛋白激酶引起，而促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在 Tua蛋白磷酸化中占有重要的位置[31-32]。Goldin发现MAPK/ERK对海马神经元树突棘结构的形成与变化具有调控作用，此过程可能与中枢神经系统信息的长期存储功能有关[33]。

本文通过网络药理学研究核桃改善记忆多靶点、多成分和多通路间复杂的相互关系，同时采用分子对接对核桃活性成分和改善记忆的潜在靶点的结合能力进行验证，发现鞣花酸、没食子酰葡萄糖均与PRKCA、PRKCB有较强的亲和力。核桃作为保健食品，目前的研究主要集中在核桃产品开发的工艺上，对核桃改善记忆的功能研究还较少，本文为核桃改善记忆的物质基础分析和作用机制的研究提供了理论基础，为核桃全产业链开发提供新思路。

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。