猫眼草提取物通过调控miR-501-3p/KPNA4轴影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

方 健，王辰男，孟庆刚

北京中医药大学，北京 100029

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，具有较高的侵袭性，易转移，导致多数患者预后不佳[1]。因此，抑制肝癌细胞的侵袭和迁移是控制肝癌复发转移的有效环节。我国药用植物丰富，传统的中草药因毒副作用低、药效强在抗肿瘤方面发挥独特的作用[2]。中草药猫眼草是大戟科大戟属植物猫眼草Euphorbia esula L.的全草，具有镇咳、祛痰、拔毒等功效。研究表明，猫眼草提取物可诱导胃癌细胞凋亡[3]，抑制乳腺癌细胞增殖[4]，发挥一定的抗肿瘤作用。但目前，猫眼草提取物对肝癌的影响还未知。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子单链非编码RNA，可与靶mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region，3′UTR)靶向结合，在转录后水平抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA，进而调控靶基因的表达，在肿瘤的发生、发展中起重要作用[5]。miR-501-3p是近年来新发现的一种miRNA。有报道称，miR-501-3p在肝癌组织中呈低表达，其表达下调与肝癌患者肿瘤进展和预后不良密切相关，过表达miR-501-3p可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭及上皮间质转化，是肝癌治疗的潜在靶点[6]。生物信息学软件预测显示，核周蛋白α4(karyopherin alpha 4，KPNA4)的3′UTR与miR-501-3p的核苷酸序列存在结合位点，其可能是miR-501-3p的靶基因。KPNA4属于α-输入蛋白家族成员，参与调控乳腺癌[7]、多形性胶质母细胞瘤[8]等肿瘤细胞增殖和迁移。但目前，KPNA4对肝癌细胞恶性生物学行为的影响还未知。本研究主要观察了猫眼草提取物对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并以miR-501-3p/KPNA4轴为切入点，观察猫眼草提取物影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭分子机制，以期为肝癌治疗药物的研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验试剂肝癌Hep3B细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培养基、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，miR-501-3p 模拟物(mimcs)及阴性对照序列、miR-501-3p抑制剂及阴性对照序列、KPNA4过表达载体(pcDNA-KPNA4)及空载体(广州市锐博生物科技有限公司)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞增殖蛋白Ki67、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、E-钙黏附素(E-cadherin)抗体(北京中杉金桥生物试剂公司)，KPNA4多克隆抗体(上海康朗生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 猫眼草提取物的制备：参照文献方法制备猫眼草提取物[9]。猫眼草干燥后粉碎，过100目筛。准确称取500 g粉末，加入14倍体积的50%乙醇，60 ℃加热回流2次，每次1 h。抽滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，真空干燥得到猫眼草提取物，其主要成分为黄酮类化合物。

1.2.2 细胞培养和转染：Hep3B细胞复苏后，用含质量浓度为100 g/L FBS的 RPMI-1640培养基置于37 ℃、体积分数为5%的CO2、湿度为97%的培养箱中培养。每2～3 d更换1次新鲜的培养基。当细胞融合至80%左右时，用质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化，以1∶3的比例进行传代培养。对数增殖期的Hep3B细胞，以1×105个/孔接种于6孔板中，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染miR-501-3p mimcs(miR-501-3p组)、mimcs阴性对照(miR-NC组)、miR-501-3p抑制剂(anti-miR-501-3p组)、抑制剂对照(anti-miR-NC组)、KPNA4过表达载体(pcDNA-KPNA4组)、miR-501-3p mimcs与空载体(miR-501-3p+pcDNA组)至Hep3B细胞。转染24 h后，更换培养基。继续培养24 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞分组处理：未转染的Hep3B细胞分为对照组：正常培养；猫眼草提取物组：不同浓度(1.25、2.5、5.0、10.0 μg/ml[10])的猫眼草提取物干预48 h。转染miR-501-3p mimcs、miR-NC的Hep3B细胞培养48 h，分别记为miR-501-3p组、miR-NC组。转染pcDNA-KPNA4、pcDNA的Hep3B细胞用5.0 μg/ml的猫眼草提取物干预48 h，分别记为猫眼草提取物+pcDNA-KPNA4组、猫眼草提取物+pcDNA组。

1.2.4 MTT检测细胞增殖：Hep3B细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，每组设置3个复孔。按照1.2.2分组处理后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/ml)，继续孵育4 h。吸弃培养基，加入150 μl二甲基亚砜溶解结晶紫，振荡混匀，于全自动酶标仪490 nm处测定吸光度值(absorbance，A)。细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.5 Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力：用不含FBS的RPMI-1640培养基调整Hep3B细胞为5×104个/ml的细胞悬液。细胞迁移实验：Transwell上室加入100 μl细胞悬液，下室加入500 μl含FBS的RPMI-1640培养基。上室细胞按照1.2.2处理后吸弃培养基。取出上室，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min。倒置显微镜观察穿膜细胞，随机选取5个视野，对穿膜细胞计数。细胞侵袭实验：以1∶8比例将预冷的Matrigel基质胶用RPMI-1640培养基稀释，铺于Transwell上室，自然晾干后，加入100 μl细胞悬液，后续操作与细胞迁移实验相同。

1.2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-501-3p和KPNA4 mRNA表达：Trizol试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度，定量后将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行扩增。扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环。miR-501-3p上游5′-GTGGCGAACGCTGATCGTGAAA-3′，下游5′-CCGTGACGTGATAGACCGT-3′；KPNA4上游5′-GTAGACAGTAGAAACGTGCT-3′，下游5′-CCGTGACAGCTGACGTGTC-3′；GAPDH上游5′-GTGCCCAGACAGCTGATCGT-

3′，下游5′-TGCGCGATGCTAGTCTTC-3′；U6上游5′-GCTGCTAACCGTACTGCTGGC-3′，下游5′-GCCCGTA-

GACTGAACGTGC-3′。miR-501-3p以U6为内参，KPNA4以GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-501-3p和KPNA4 mRNA的相对表达水平。

1.2.7 Western blotting法检测蛋白表达：RIPA蛋白裂解液充分裂解细胞，提取细胞中总蛋白。BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度后进行定量。取适量蛋白溶液，加入上样缓冲液，混匀后100 ℃煮沸5 min。蛋白变性后，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每泳道蛋白上样量30 μg。电泳后，湿转至聚偏乙烯二氟膜。转膜后，于质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉中封闭2 h。分别加入稀释后CyclinD1(1∶1 000)、Ki67(1∶800)、MMP-2(1∶1 000)、E-cadherin(1∶600)和KPNA4(1∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜。加入二抗(1∶400)，37 ℃孵育1 h。加入化学发光试剂ELC避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-501-3p与KPNA4靶向关系：生物信息学软件预测显示，KPNA4的3′UTR与miR-501-3p的核苷酸序列存在连续的结合位点，提示KPNA4是miR-501-3p的靶基因。PCR扩增含miR-501-3p结合位点的KPNA4的3′UTR序列，将其克隆到GV272载体中，构建KPNA4野生型荧光素酶载体(WT-KPNA4)。同时利用基因定点突变技术，将结合位点突变后克隆至GV272载体，构建KPNA4突变型荧光素酶载体(MUT-KPNA4)。分别将WT-KPNA4、MUT-KPNA4与miR-501-3p mimic或miR-NC共转染至Hep3B细胞。转染24 h后，收集细胞，检测荧光素酶活性。具体操作参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，结果以萤火虫荧光素酶的荧光强度与海肾荧光素酶的荧光强度比值表示。

2 结果

2.1 猫眼草提取物对肝癌Hep3B细胞增殖的影响与对照组比较，猫眼草提取物组细胞存活率、CyclinD1和Ki67蛋白表达降低(P<0.001)。当猫眼草提取物浓度为5.0 μg/ml时，细胞存活率为(52.18±3.41)%，接近半数抑制率，因此选择该浓度进行后续实验(见图1、表1)。

图1 猫眼草提取物对Hep3B细胞CyclinD1和Ki67蛋白表达的影响

表1 猫眼草提取物对Hep3B细胞存活率、CyclinD1和Ki67蛋白表达的影响Tab 1 The effects of Enphorbia lunulata Bge extract on Hep3B cell survival rate and the expressions of CyclinD1 and Ki67

2.2 猫眼草提取物对肝癌Hep3B细胞迁移和侵袭的影响与对照组比较，猫眼草提取物组迁移和侵袭细胞数、MMP-2蛋白表达均降低(P<0.001)，E-cadherin蛋白表达升高(P<0.001)(见图2、表2)。

2.3 猫眼草提取物对肝癌Hep3B细胞miR-501-3p和KPNA4表达的影响与对照组比较，猫眼草提取物组Hep3B细胞中miR-501-3p表达升高(P<0.001)，KPNA4 mRNA和蛋白表达降低(P<0.001)(见图3、表3)。

图2 猫眼草提取物对Hep3B细胞MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

表2 猫眼草提取物对Hep3B细胞迁移和侵袭数、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

图3 猫眼草提取物对Hep3B细胞KPNA4蛋白表达的影响

表3 猫眼草提取物对Hep3B细胞miR-501-3p和KPNA4表达的影响

2.4 miR-501-3p过表达对肝癌Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响miR-501-3p组miR-501-3p水平高于miR-NC组(P<0.05)，表明miR-501-3p mimics转染成功，Hep3B细胞中miR-501-3p过表达。与miR-NC组比较，miR-501-3p组细胞存活率、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、Ki67和MMP-2蛋白表达均降低(P<0.001)，E-cadherin蛋白表达升高(P<0.001)(见图4、表4)。

图4 miR-501-3p过表达对Hep3B细胞CyclinD1、Ki67、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

表4 miR-501-3p过表达对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响Tab 4 Effects of miR-501-3p overexpression on proliferation, migration and invasion of Hep3B cells

2.5 miR-501-3p靶向负调控KPNA4表达Target Scan生物信息学软件预测显示，KPNA4的3′UTR与miR-501-3p的核苷酸序列存在结合位点(见图5A)。miR-501-3p mimics可降低WT-KPNA4的荧光素酶活性(P<0.001)，而对MUT-KPNA4的荧光素酶活性无影响(P=0.069)(见表5)。miR-501-3p组KPNA4蛋白水平低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-501-3p组KPNA4蛋白水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)(见图5B、表6)。说明miR-501-3p靶向负调控KPNA4表达。

注：A：KPNA4的3′UTR与miR-501-3p的核苷酸序列存在的结合位点；B：miR-501-3p对KPNA4蛋白表达的影响。

表5 双荧光素酶活性检测结果Tab 5 The results of the double luciferase activity assay

2.6 KPNA4过表达降低猫眼草提取物对肝癌Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响与猫眼草提取物+pcDNA组比较，猫眼草提取物+pcDNA-KPNA4组细胞存活率、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、Ki67和MMP-2蛋白表达均升高(P<0.001)，E-cadherin蛋白表达降低(P<0.001)(见图6、表7)。

表6 miR-501-3p对KPNA4蛋白表达的影响Tab 6 The effects of miR-501-3p on the expression of KPNA4

图6 KPNA4过表达降低猫眼草提取物对CyclinD1、Ki67、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响

表7 KPNA4过表达降低猫眼草提取物对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的影响Tab 7 Overexpression of KPNA4 reduced the effects of Enphorbia lunulata Bge extract on the proliferation, migration and invasion of Hep3B cells

3 讨论

中草药作为中国医学用来防治疾病的有力武器，具有价格低廉、毒副作用小、增强放化疗敏感性等特点，可弥补现代医学肿瘤治疗方法的不足，研究中草药的抗癌作用及机制对于肿瘤的治疗具有积极意义。猫眼草在我国东北、陕西、江苏等地广泛分布，是中国中药草中的一种。研究显示，猫眼草提取物具有抗氧化[11]、抑菌[12]及抗乳腺癌[13]和胃癌[14]细胞增殖的活性。但目前猫眼草提取物是否发挥抗肝癌作用还未知。

细胞增殖紊乱是肿瘤发生、发展的主要机制。CyclinD1是细胞周期关键调控蛋白，加速细胞周期由G1期向S期转变，促进细胞增殖[15]。Ki67是一种细胞增殖核抗原，目前已知的反映细胞增殖状态的标志物[16]。本研究显示，猫眼草提取物作用于肝癌Hep3B细胞后，细胞存活率降低，CyclinD1和Ki67蛋白表达降低，提示猫眼草提取物可能通过抑制CyclinD1和Ki67蛋白表达来抑制肝癌细胞增殖。肿瘤复发、转移是肿瘤治疗失败的主要原因，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭是防止肿瘤复发、转移的关键[17]。MMP-2参与降解细胞外基质和基底膜，促进细胞迁移和侵袭[18]。E-cadherin是细胞黏附分子，表达缺失易于细胞脱落、发生迁移及侵袭[19]。本研究显示，猫眼草提取物可降低肝癌细胞迁移和侵袭数及MMP-2蛋白表达，促进肝癌细胞中E-cadherin蛋白表达，提示其可能通过调控MMP-2和E-cadherin蛋白表达抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。上述结果表明，猫眼草提取物可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力，具有研发为肝癌治疗药物的潜在价值。

miRNA参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为，是肿瘤治疗的潜在靶点。研究表明，miR-501-3p在非小细胞肺癌[20]、胰腺导管腺癌[21]、前列腺癌[22]等肿瘤细胞中表达降低，过表达miR-501-3p可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，这与本研究结果过表达miR-501-3p可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭一致。为了探讨猫眼草提取物抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制，本研究检测了猫眼草提取物对肝癌细胞miR-501-3p表达的影响，结果显示，猫眼草提取物可促进肝癌细胞表达miR-501-3p，提示猫眼草提取物可能通过上调miR-501-3p表达发挥抗肝癌作用。

生物信息学软件预测显示，KPNA4可能是miR-501-3p的靶基因。KPNA4是介导多种转录因子核易位的重要蛋白，与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示，KPNA4在肺癌细胞中表达升高，抑制其表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和血管生成[23]。下调KPNA4表达可抑制皮肤鳞状细胞癌增殖并降低肿瘤细胞对顺铂耐药性[24]。敲除KPNA4表达可显著降低前列腺癌移植瘤小鼠肿瘤侵袭和远处转移[25]。但目前KPNA4对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响还未知。本研究通过荧光素酶报告基因实验及Western blotting证实了miR-501-3p在肝癌Hep3B细胞中靶向负调控KPNA4表达，这也与猫眼草提取物促进Hep3B细胞miR-501-3p表达，而抑制KPNA4 mRNA和蛋白表达的结果一致。本研究还显示，KPNA4过表达降低了猫眼草提取物对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示猫眼草提取物通过靶向上调miR-501-3p表达，进而抑制KPNA4 表达发挥抗肝癌作用。

综上所述，猫眼草提取物可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，其可能通过调控miR-501-3p/KPNA4轴发挥抗肝癌作用，具有开发为治疗肝癌药物的潜在价值。但本研究仅在细胞层面进行了初步探讨，接下来将通过动物实验进一步验证猫眼草提取物的抗肿瘤作用及其他调控机制。