木鳖子炮制前后脂肪油提取工艺及气相色谱-质谱联用分析研究

江 瑜，姚梦雪，张姗姗，苏 敏，范兰兰，汪小莉，洪 燕，桂双英，韩燕全

(1. 安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室 中药复方安徽省重点实验室现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

木鳖子是葫芦科植物木鳖Momordicacochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种子，是临床常用中药，具有散结消肿、攻毒疗疮的功效，可用于治疗疮痈肿痛、瘰疬、痔疮等证[1]。木鳖子最早载于宋代《开宝本草》，亦收载于2015年版《中华人民共和国药典》，其生品有毒，内服时需要“去油制霜”以降低毒性和减轻不良的油腻气。研究[2]表明，木鳖子富含脂肪油，其含量在40%左右，且具有一定的刺激性及泻下作用，但药理研究同时发现，部分脂肪油成分具有生物活性，且在抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面具有重要作用。因此，也不能将木鳖子中的脂肪油完全除去，宜控制木鳖子霜含油量在18%～20%[3]。本实验采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技术对木鳖子和木鳖子霜脂肪油成分进行分析，以期发现两者之间的脂肪油成分差异，为木鳖子炮制前后的脂肪油成分变化规律及炮制机制的研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 456-GC型气相色谱-质谱联用仪、SCIION单四级杆：德国Bruker公司；JM-A20001型电子天平：余姚纪铭称重校验设备有限公司；KDC-16H型高速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；KQ3200DB型超声仪：江苏昆山超声仪器有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅：上海三发科学仪器有限公司；BZF-6050型真空干燥箱：上海博讯实业有限公司。

1.2 药材与试剂 木鳖子(批号 20180705)由亳州市佰世信中药饮片有限公司提供，经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任中药师鉴定为葫芦科植物木鳖Momordicacochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种子。石油醚(沸程 60～90 ℃，批号 20170703)：上海沃凯生物技术有限公司；KOH(批号 20171101JN)：上海润捷化学试剂有限公司；14%三氟化硼-甲醇溶液：上海麦克林生物制药有限公司；NaCl(批号 F20100330)：国药集团化学试剂有限公司；正己烷(批号 20141112)：天津市光复精细化工研究所；无水Na2SO4(批号 13-2010292-171)：上海金山化工厂；高纯氦气(纯度≥99.999%)：南京上元工业气体厂。

2 方法

2.1 木鳖子生品与木鳖子霜的制备 木鳖子生品：取木鳖子，去壳得木鳖子种仁，粉碎后过一号筛，即得木鳖子生品。木鳖子霜：结合课题组前期实验基础[4]，主要方法为取上述制备的木鳖子生品适量，置于真空干燥箱内，在80 ℃条件下烘制1.7 h，取出后用草纸包裹放置于自制机械榨油设备内，压制至草纸上不再出现油渍为止，即得木鳖子霜。

2.2 脂肪油提取工艺的考察 木鳖子脂肪油主要的提取工艺条件为料液比、提取时间和提取温度，因此采用正交法对这3种因素进行考察与优化，并根据预实验结果设置3个水平。分别取“2.1”项下制备的木鳖子生品和木鳖子霜3 g，置于索式提取器中，加入一定量石油醚水浴回流，以料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)为考察因素，脂肪油得率为指标，对木鳖子脂肪油提取工艺进行考察，采用L9(34)正交表进行试验设计，对各因素各水平进行优选，具体实验安排见表1。

表1 正交实验因素水平表

2.3 脂肪油得率的测定 取干燥恒质量的蒸发皿，称取质量为m1，将正交所得的木鳖子脂肪油提取液置于其中，置于水浴锅上低温蒸干，除去有机溶剂，放冷后称取质量，记录此时的质量为m2，计算脂肪油得率。脂肪油得率=[(m2-m1)/药材加入量]×100%。

2.4 脂肪油的甲酯化 精密称取脂肪油50 mg，加入0.5 mol/L的KOH甲醇溶液1 mL，60 ℃水浴30 min，取出放冷，加入14%的三氟化硼-甲醇溶液1 mL，60 ℃水浴20 min，取出放冷，再分别加入饱和NaCl溶液和正己烷1 mL，取上清液加无水Na2SO4干燥，即得供试品溶液。

2.5 气相色谱-质谱条件 色谱条件：毛细管色谱柱(30.0 μm×250 μm，0.25 μm)，载气为高纯氦气，流量为1 mL/min，分流模式(分流比为20∶1)，进样量为1 μL。程序升温：初始温度150 ℃，以5 ℃/min升至190 ℃，保持5 min；再以2 ℃/min升至260 ℃，并保持3 min；最后温度降至150 ℃。质谱条件：离子源和接口温度分别为219.3 ℃、278.5 ℃，EI电离，碰撞能量为70 eV；全扫描模式，扫描范围m/z为50～500，质谱检索标准库：NIST11。

2.6 多元统计分析 将GC-MS数据进行峰对齐、切割、滤噪等预处理后，导入Excel中对数据进行面积归一化，再将数据导入SIMCA-P 13.0软件(Umetrics AB，Umea，Sweden)，对数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthgnal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)，并结合变量重要性投影(variable importance projection,VIP)值得到差异化学成分，最后通过工作站自带的质谱数据库(NIST11)检索匹配进行化学成分指认。

3 结果

3.1 脂肪油提取工艺正交试验结果 按照L9(34)正交表进行正交试验，每组试验平行3次，以脂肪油得率为指标，对脂肪油提取的料液比、提取温度、提取时间进行考察，来确定最终的提取工艺。其中，因素D为空白项。试验结果及方差分析见表2、表3。

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析表

根据表2直观分析结果可知，各因素对实验结果影响程度依次为C、B、A，即提取温度、提取时间、料液比。根据表3方差分析结果，A(料液比)、B(提取时间)的差异无统计学意义，C因素(提取温度)的差异有统计学意义(P<0.05)。选择最高的水平，其最佳组合为A3B2C3，即料液比为1∶40，提取时间为6 h，提取温度为85 ℃。

3.2 验证试验 为进一步考察工艺的稳定性与准确性，根据正交试验确定的最佳工艺，提取3批木鳖子生品与木鳖子霜脂肪油，计算其脂肪油提取率，结果表明该脂肪油提取工艺稳定、可行。见表4。

表4 木鳖子脂肪油提取率

3.3 木鳖子制霜前后化学成分分析 根据优选的脂肪油提取工艺，分别提取6份木鳖子生品和木鳖子霜的脂肪油，并使用GC-MS对木鳖子生品与木鳖子霜脂肪油成分进行分析，分别得到两者的GC-MS总离子流图，见图1。经GC-MS工作站自带的数据库NIST11匹配与鉴定，从木鳖子生品与木鳖子霜中共鉴定出脂肪油类成分14种，并通过面积归一化法计算出14种成分的平均含量比例，结果表明有11种脂肪油成分含量升高，3种成分含量降低，具体成分信息见表5。

注：A.木鳖子生品；B.木鳖子霜

表5 木鳖子炮制前后脂肪油成分

3.4 木鳖子生品与木鳖子霜差异性脂肪油成分识别 为比较木鳖子生品与木鳖子霜脂肪油成分的区别，对GC-MS所得数据进行OPLS-DA(见图2)。结果显示，木鳖子生品组与木鳖子霜组分属于不同象限中，其中木鳖子生品组处于第二、第三象限，木鳖子霜组处于第一、第四象限，且互不交叉重叠，说明制霜前后木鳖子脂肪油成分确实发生了明显的差异。此外，聚类分析结果(见图3)显示，木鳖子生品S1—S6能很好地聚为一类，木鳖子霜P1—P6较好地聚为另一类，此结果更加证实了木鳖子制霜前后脂肪油类成分的差异。

为寻找木鳖子制霜前后脂肪油类差异性成分，以VIP为指标描述变量的贡献程度，当VIP>1时，则认为该变量有显著差异。通过对其VIP图进行考察，筛选得到的VIP>1的差异性化学成分，将质谱图与NIST数据库进行鉴定，共确定8种差异性化合物，分别为壬二酸、十四烷酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸、桐酸、10，12-十八碳二烯酸。通过8个化合物在6批样品中分布情况比较可以发现，木鳖子在制霜过程中并未产生新的脂肪油成分，只是在含量上存在明显的差异。其中壬二酸、十四烷酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸6种成分含量显著上升，桐酸、10，12-十八碳二烯酸2种成分含量显著下降。见表6。

注：S.木鳖子生品；P.木鳖子霜

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6为木鳖子生品，聚为一类；P1、P2、P3、P4、P5、P6为木鳖子霜，聚为一类

表6 木鳖子炮制前后8种差异性脂肪油成分峰面积趋势

4 讨论

笔者对索氏提取法、超声波萃取法以及冷浸法[6-8]这3种常用的脂肪油提取方法进行考察，发现这3种提取方法中，索氏提取法的提取率最高。因此，本研究采用索氏提取法对木鳖子炮制前后的脂肪油进行提取。此外，还对常用的甲酯化的方法，如氢氧化钾-甲醇法、三氟化硼-甲醇法及酸碱结合法[9-11]进行考察，发现采用三氟化硼-甲醇法对脂肪油进行甲酯化的过程操作简便，并且甲酯化的效果较好，因此，本研究采用三氟化硼-甲醇方法对提取的脂肪油进行甲酯化。

木鳖子制霜前后的脂肪油成分研究表明，制霜后总脂肪油含油率从33.56%降低到19.14%，和文献[3]报道的含量接近。通过GC-MS对其成分进行分析鉴定，共得到14种脂肪油成分，木鳖子制霜后，3种多元分析方法综合结果显示壬二酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸等8种成分含量变化有显著性差异，提示其可能是影响木鳖子炮制前后质量差异和药效的脂肪油类成分。其中壬二酸、十四烷酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸6种成分含量显著上升，这可能是因为随着制霜过程中使得具有刺激性及油腻气味的成分含量降低，使得6种活性脂肪油和其他有效成分的相对含量随之增高。现代研究[12-13]已证实棕榈酸、油酸、亚油酸等具有抗感染、抗肿瘤等药效。木鳖子制霜后的脂肪油总含量降低，而部分脂肪油相对含量升高，可能是其减毒增效的部分机制，但是对药理活性的影响需要进一步研究。