棉花耐低氮和氮敏感种质筛选及验证

王准，张恒恒，董强，贵会平，王香茹，庞念厂，李永年，牛静，靳丁沙，汪苏洁，张西岭，宋美珍

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳455000）

棉花作为我国重要的经济作物和纺织工业原料， 其产业涉及2 000 多万纺织工人的就业和近1 亿棉农的收入问题。 棉农为提高产量而大量施用化肥，以新疆棉田为例，化肥施用量为462.9 kg·hm－2， 其中氮肥施用量高达300 kg·hm－2，远高于全球农作物化肥施用量120 kg·hm－2[1]。过量施用造成氮肥利用率降低， 大量肥料氮流失，导致温室效应、 水体富营养化等严重的环境问题。棉花生产和资源环境的矛盾限制着棉花种植和产量潜力的发挥[2-3]。 如何提高氮素的利用效率，减少氮肥投入是目前亟需解决的问题。 但作物的氮素利用效率不仅与环境条件有关，而且与品种自身的吸收和利用能力有关[4-9]。 因此，挖掘棉花氮高效利用和耐低氮的基因潜力，选育棉花氮高效新品种，是提高氮效率，降低环境污染的最经济有效途径。

目前，氮素养分高效利用已成为国际农业研究热点，其中关于作物耐低氮种质的筛选及机制的研究有大量报道，主要在水稻[10]、小麦[11]、玉米[12-13]等作物上。 不同作物种质之间氮效率存在显著差异[14]，主要表现在氮素吸收效率和利用效率[15]。为了发挥作物品种的高产潜力，许多育种种质都是在高氮环境中筛选的，但可能在缺氮的情况下表现不好。 这就需要同时在低氮和高氮条件下测定相关指标去鉴定氮高效种质[16]。 棉花耐低氮种质筛选起步较晚，只有少量报道。韩璐等[17]以相对整株干物质质量为筛选指标，在苗期将新疆33 个主栽品种分为高效、 低效与中间型3 类；郑顺利等[18]根据总相对干物质质量、总氮积累量、地上部含氮量等6 个指标对30 个棉花品种进行聚类分析，筛选出5 个氮高效品种和3 个氮低效品种。 以上研究的品种收集范围局限在当地，样本容量小，遗传背景较窄，筛选出的品种的差异可能较小。 同时评价棉花氮素利用效率的指标很多， 仅采用单一指标和统计学方法如聚类分析、相关分析等难以全面反映耐低氮胁迫能力；因此，须构建合理的筛选指标体系，综合采用多指标评价方法，进行全面准确的筛选鉴定。 产量是棉花的主要经济性状，也是评价棉花耐低氮能力的重要指标，但通过苗期筛选和田间产量验证综合筛选棉花氮高效种质尚未见报道。

因此，本研究以中国农业科学院棉花研究所植棉技术标准化课题对370 份国内外有代表性的种质进行沙培筛选后获得的80 份不同氮吸收利用效率棉花种质为研究对象，采用水培及田间验证等方式，在低氮和正常氮条件下研究苗期不同种质棉花对氮素吸收利用的差异，构建苗期筛选指标体系，采用聚类热图分析、氮效率综合值等评价方法，进一步筛选不同氮效率种质，并与田间筛选结果对比分析，以期综合评判出氮高效种质，为研究棉花氮素高效利用机理提供方法和基础材料。

1 材料与方法

1.1 供试种质

供试种质为中国农业科学院棉花研究所植棉技术标准化课题经初筛[19-20]后获得的80 份棉花种质，由中国农业科学院棉花研究所种质资源库提供。

1.2 试验设计

1.2.1 水培试验。 水培试验于河南省安阳市中国农业科学院棉花研究所温室内进行， 昼/ 夜温度28℃/20℃，光周期（昼/夜）16 h/8 h。 将种子置于混有蛭石的湿沙土中萌发， 出苗4 d 后移入水培盒（33 cm×24 cm×12 cm）中，上面覆盖具有12个孔的泡沫板，每孔定植1 株棉苗，用海绵包茎以固定植株，每天加入50 mL 的去离子水以补充因蒸腾而消耗的水分，并以充气泵连续通气。 每5 d 更换1 次营养液，35 d 后取样测定相关性状。氮素以Ca（NO3）2提供，根据课题组前期试验结果[19-20]，设 低 氮（N0）0.25 mmol·L－1和 正 常 氮（N1）5 mmol·L－1两个处理。 Hoagland 营养液配方[20]：400 μmol·L－1CaSO4，200 μmol·L－1K2SO4，175 μmol·L－1KH2PO4，100 μmol·L－1MgSO4，20 μmol·L－1Fe-EDTA，5 μmol·L－1KCl，2.5 μmol·L－1H3BO3，0.2 μmol·L－1CuSO4，0.2 μmol·L－1ZnSO4，0.2 μmol·L－1MnSO4，0.05 μmol·L－1Na2MoO4。 低氮处理中加入CaCl2至渗透压与正常氮处理一致。

1.2.2 田间试验。 田间试验于2017―2018 年连续2 年在河南省安阳县中国农业科学院棉花研究所东场试验基地（36°06′N，116°21′E）进行。 设置2 个施氮处理：低氮处理N0（0 kg·hm－2）和正常氮处理N1（225 kg·hm－2），每个种质进行单行区种植，行长8 m，行距0.8 m，密度52 500 株·hm－2，重复3 次，重复间走道1 m。氮肥为尿素，分2 次施用， 基施50%和初花期追施50%； 磷肥（P2O5）120 kg·hm－2、钾肥（K2O）150 kg·hm－2均作为底肥一次性施入；田间管理及病虫害防治按照常规进行。 试验地耕层土壤pH 8.67；土壤基础肥力： 有机质含量1.75 g·kg－1， 全氮含量1.16 g·kg－1， 碱解氮含量74.21 mg·kg－1， 速效磷含量10.55 mg·kg－1，速效钾含量199.1 mg·kg－1。

1.3 测定项目

水培试验：测定株高、根长、根系表面积、根体积。

根干物质质量和地上部干物质质量：在105 ℃下杀青30 min，80 ℃下烘干至质量恒定， 冷却至室温后称量地上部及根生物量，取平均值。

氮含量：使用浓H2SO4-H2O2法[21]消煮后，使用凯式定氮法测定。

计算公式如下：氮积累量＝植株总干物质质量×植株氮含量； 氮利用效率＝总干物质质量/总氮积累量，即植株体内单位质量氮所形成的生物量；氮吸收效率＝氮积累量/ 供氮量[34]；耐低氮值＝低氮下性状测定值/正常氮性状测定值。

产量调查：田间试验分区收获，实收计产，3次重复取平均值，并折合为公顷产量。

1.4 氮效率综合值计算及分类方法

采用隶属函数法将评价指标计算为氮效率综合值来代表不同供氮条件下不同种质的氮素吸收效率[20]。 公式：

Uij表示第i 种质第j 评价指标的氮效率隶属函数值；Xij表示第i 种质第j 评价指标的测定值；Xjmin、Xjmax分别表示第j 评价指标的最小值和最大值。

采用客观赋权法计算权重，公式：

Ej表示第j 评价指标的权重；Cj表示第j 评价指标的变异系数。

氮效率综合值 （N efficiency comprehensive index，NEI）计算公式：NEI＝∑（Uij×Ej）.

1.5 数据分析方法

使用MS Excel 整理数据，使用SPSS 18.0 进行方差分析、相关性分析和主成分分析（Principal component analysis, PCA）； 热图聚类分析采用Heml 1.0-Heatmap Illustrator 的欧式距离平方法。

2 结果与分析

2.1 苗期性状及氮效率指标差异

2 个氮处理下棉花种质间农艺性状及氮吸收利用效率存在显著差异（表1）。 方差分析结果表明， 各指标在种质和氮水平间存在极显著差异（P＜0.01），同时氮水平和种质间交互作用达到显著水平，表明不同种质间在2 个氮处理下各性状均差异显著。 因此，在该低氮浓度下进行筛选是可行的。 正常氮水平下总干物质质量、株高和总氮积累量， 分别比低氮水平高56.4%、56.6%、72.9%。 但低氮水平下根干物质质量高于正常氮水平下。

品种间各性状指标的变异程度是衡量筛选指标是否适宜的重要依据，变异程度大，则该指标有利于显示种质间的差异[22]。 在正常氮水平条件下，变异系数表现为地上部氮积累量＞根氮积累量＞总氮积累量＞氮吸收效率＞地上部干物质质量＞根干物质质量＞根体积＞总干物质质量＞根系表面积＞根长＞株高＞氮利用效率；在低氮水平下呈现相似规律， 根体积＞根氮积累量＞根系表面积＞根干物质质量＞根长＞地上部干物质质量＞地上部氮积累量＞总干物质质量＞总氮积累量＞氮吸收效率＞株高＞氮利用效率。 上述结果表明，干物质质量、氮积累量、氮吸收效率等指标可以作为筛选指标。

2.2 苗期性状及氮效率指标主成分分析及相关性分析

为消除种质间自身生物学特性的差异，确定主要筛选指标，对低氮和正常氮水平处理下各性状指标进行主成分分析，结果见表2。在低氮和正常氮水平下分别提取3 个主成分，累积贡献率分别为86.10%和84.03%。 在低氮条件下，提取了3个主成分，第一主成分贡献率为64.27%，主要由总干物质质量（Total dry biomass, TDB）、地上部干物质质量 （Above-ground dry biomass, ADB）、根干物质质量（Root dry biomass, RDB）、总氮积累量（Total nitrogen accumulation, TNA）、地上部氮积累量 （Above-ground nitrogen accumulation,ANA）、氮吸收效率（Nitrogen absorption efficiency,NAE）决定，主要为反映植株生物量、氮积累量和氮素吸收效率的指标。 在正常氮条件下，第一主成分贡献率为62.85%，主要决定因素与低氮条件下相同。 主成分分析能够直观地反映氮高效种质筛选指标的主次作用，综合评价不同种质的差异。 因此，根据筛选指标的变异系数及主成分分析结果初步确定总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、总氮积累量、地上部氮积累量、氮吸收效率为筛选指标。

表1 在不同氮处理下棉苗主要性状的变异Table 1 Variation of main traits of cotton seedlings under different nitrogen treatments

表2 苗期性状及氮吸收利用效率指标主成分分析Table 2 Principal component analysis of seedling traits, nitrogen absorption efficiency and nitrogen utilization efficiency

为确定筛选指标的准确性， 对总干物质质量、地上部干物质质量、总氮积累量等6 个指标进一步作相关性分析（表3，右上部为正常氮水平下相关性， 左下部为低氮水平下各性状间相关性）。 在低氮和正常氮水平下，6 个筛选指标间显著正相关，表明这6 个指标在反映棉花种质的氮高效能力上具有一致性，可作为筛选耐低氮棉花种质的指标。

2.3 基于耐低氮值的聚类分析

以6 个筛选指标的耐低氮值作为指标，采用欧式距离平方法进行聚类热图分析，颜色变化梯度可以直观地反映数据的大小及差异（图1）。 根据聚类分析结果分为7 类， 第Ⅰ类有6 个种质（分别为鲁05R59、新陆早34 号、中棉所69、新陆早35 号、垦6641、军棉1 号），总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、地上部氮积累量、总氮积累量及氮吸收效率均较大；第Ⅱ类有18 个种质（运早N177、新陆中4 号、新陆中22 号等），表现为根干物质质量耐低氮值较小，第Ⅲ类12 个种质（鲁棉研28、中棉所17、新陆中30 号等），总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、地上部氮积累量、总氮积累量及氮吸收效率均表现为最小；第Ⅳ类6 个种质表现为根干物质质量耐低氮值最小，其他性状较大；第Ⅴ类9个种质（新陆早9 号、中棉所14、新棉33B 等），表现为地上部氮积累量、总氮积累量及氮吸收效率耐低氮值最小；第Ⅵ类16 个种质（鲁棉2153、石早1 号、 新陆早20 号等） 表现为根干物质质量、地上部氮积累量、总氮积累量及氮吸收效率耐低氮值最小；第Ⅶ类13 个种质（邯686、晋棉23 号、 辽棉10 号等） 表现为地上部氮积累量最小，其他性状耐低氮值较大。 综合分析，第Ⅰ类6个种质为耐低氮种质， 第Ⅲ类12 个种质为低氮敏感型。

2.4 不同氮水平下棉花苗期氮效率综合值分析

确定总干物质质量、 地上部干物质质量、根干物质质量、总氮积累量、地上部氮积累量、氮吸收效率为综合评价指标，采用隶属函数法复合运算得到在低氮和正常氮处理下不同种质的氮效率综合值（表4）。在正常氮和低氮条件下，不同种质的氮效率综合值存在显著性差异。 以低氮和正常氮处理下不同种质的氮效率综合值作散点图，如图2 所示将不同种质分成4 类： 双高效型（Efficient-efficient, EE）有24 个，占30%；低氮高效型（Efficient-inefficient, EI）有13 个，占16.25%；双低效型（Inefficient-inefficient, II）有29 个，占36.25%；正常氮高效型（Inefficient-efficient,IE）有14 个，占17.5%。 前述聚类热图分析得到的6 个耐低氮种质中2 个属于双高效型，12 个氮敏感种质中有2 个属于双低效型。经综合分析，初步将鲁05R59、中棉所69 定为耐低氮、氮高效种质，珂字棉201、新陆中30 号定为氮敏感、氮低效种质。

2.5 耐低氮种质苗期根系差异

表3 不同氮水平下干物质质量、氮积累量、氮吸收效率等指标相关性分析Table 3 The correlation analysis between dry total biomass, nitrogen accumulation and nitrogen absorption efficiency under different nitrogen treatments

根系构型是影响氮素吸收的重要因素，根系性状的种质差异与氮效率有密切联系[14,34]。 本研究中氮胁迫显著降低了干物质积累（表5），低氮处理下珂字棉201、新陆中30 号、鲁05R59、中棉所69 等种质总干物质质量小于正常氮处理下。正常氮处理下，总干物质质量、根冠比、根长、根系表面积、根体积、氮吸收效率等性状，鲁05R59、中棉所69 显著大于珂字棉201、新陆中30 号；低氮处理下，根长差异不显著。 在低氮处理下，珂字棉201、新陆中30 号的根系表面积分别为正常氮处理的83.66%、77.37%，鲁05R59、中棉所69 分别为正常氮处理的48.09%、59.46%，受氮胁迫影响较大。 本研究中种质间氮利用效率差异不显著，氮吸收效率差异明显；低氮水平下，氮吸收效率显著提高，鲁05R59、中棉所69 的氮吸收效率显著大于珂字棉201、新陆中30 号，同时根系性状优于珂字棉201、新陆中30 号，表明在氮素胁迫条件下，根系形态对氮吸收效率起重要作用。

图1 不同种质棉花指标耐低氮值聚类图Fig. 1 Heatmap clustering for low nitrogen tolerance value in different germplasms of cotton

2.6 基于产量的棉花耐低氮能力田间筛选

为进一步检验棉花耐低氮能力， 开展以产量为评价指标的田间筛选。 以田间2 个氮处理下产

量做散点图， 并以产量平均值将不同品种分为4类（图3），2017 年双高效型（2 个氮处理下产量大于平均值，EE1）共28 个，占35%；低氮高效型（低氮处理产量大于平均值， 正常氮处理产量小于平均值，EI1）共7 个，占8.75%；双低效型（2 个氮处理下产量小于平均值，II1）共37 个，占46.25%；正常氮高效型（正常氮处理产量大于平均值，低氮处理产量小于平均值，IE1）共8 个，占10%。 2018 年田间试验双高效型共34 个，占42.5%；低氮高效型共5 个，占6.25%；双低效型共31 个，占38.75%；正常氮高效型共10 个，占12.5%。

表4 2 个氮水平（N1、N0）下棉花苗期氮效率综合值Table 4 N efficiency comprehensive index under different nitrogen levels (N1, N0)

表4 （续）Table 4 (Continued)

图2 2 个氮水平下不同种质氮效率综合值散点图Fig. 2 Scatter map of nitrogen efficiency comprehensive value under different nitrogen levels

在2 年的田间试验中， 双高效型和双低效型品种数量均较多，共65 个，占比81.25%，这与苗期氮效率综合值的分类结果相似。在田间试验（图3、4）中，鲁05R59 和中棉所69 划分为双高效型种质，珂字棉201、新陆中30 号划分为双低效型种质， 苗期筛选与田间鉴定结果一致， 最终确定鲁05R59、中棉所69 为耐低氮、氮高效种质，珂字棉201、新陆中30 号为低氮敏感、氮低效种质，可作为研究棉花耐低氮机理的理想种质。

表5 珂字棉201、新陆中30 号、鲁05R59、中棉所69 苗期性状Table 5 Seedling traits of Coker 201, Xinluzhong 30, Lu05R59 and CCRI 69

图3 2017 年、2018 年不同氮水平下田间籽棉产量散点图Fig. 3 Scatter plot of seed cotton field yield under different nitrogen levels in 2017 and 2018

图4 2017 年、2018 年珂字棉201、新陆中30 号、鲁05R59、中棉所69 田间籽棉产量比较Fig. 4 Comparison of seed cotton yields between the fields of Coker 201, Xinluzhong 30, Lu05R59 and CCRI 69 in 2017 and 2018

3 讨论

3.1 棉花苗期不同氮水平下农艺性状及氮效率的种质差异

挖掘棉花自身的氮利用潜力，培育氮高效品种是提高氮素利用效率，减少氮素损失的重要途径。 试验结果表明，供试棉花种质在低氮和正常氮水平下苗期各指标存在显著性差异（表1），与水稻[22]、小麦[23]、玉米[24]等研究结果一致。 供氮水平显著影响植株的生长，氮胁迫会抑制作物的生长发育[25]。 随着施氮量的增加，株高、干物质质量和氮含量等指标显著提高（表1），低氮处理的根冠比较大，与前人的研究结果[13]一致。根系构型是影响作物生长和氮素吸收的重要因素之一，在氮胁迫下更多的光合物质被用来构建发达的根系（如根长、根系表面积、根体积等），进而吸收更多的氮素，促进植株干物质的形成与积累[26]。本研究发现与正常氮处理相比，低氮处理下根干物质质量略高， 根长、 根系表面积和根体积无显著性差异。 作物的氮效率主要由氮吸收效率和氮利用效率共同决定[27-28]。本研究中不同种质间氮吸收效率和利用效率差异显著， 低氮和正常氮条件下氮吸收效率变异系数均显著高于氮利用效率， 表明棉花苗期氮吸收效率对氮效率的贡献起主导作用。

3.2 棉花苗期氮高效筛选指标的确定

关于小麦、玉米、水稻等作物的氮高效种质筛选已有大量报道，但受环境、筛选时期、作物种类等因素影响，所用筛选指标及评价方法不尽相同[29]。 其中土壤与作物分析仪（Soil and plant analyzer development,SPAD)叶绿素测定值、株高、产量、含氮量、酶活性等指标可以用于评价作物耐低氮能力，但至今没有统一的选择标准[30]。种质间的变异系数是衡量某一性状指标能否作为筛选评价的重要依据，变异系数越大则表示该指标的灵敏度越高[17]。 如杜保见等[31]根据小麦苗期性状变异大小选择了茎叶干物质质量等指标为综合筛选指标。在本研究中，2 个氮水平下各性状指标的变异系数均较大，种质间各性状差异明显。 不同指标在评价作物耐低氮能力中主次作用不一，在低氮和正常氮处理下第一主成分均由总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、总氮积累量、地上部氮积累量、氮吸收效率组成（表2）；进一步进行相关性分析，这6 个指标之间相关性显著（表3），表明将总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、总氮积累量、地上部氮积累量、 氮吸收效率作为筛选评价指标是合理的。 许多氮高效作物品种筛选研究只是通过简单聚类分析开展[31-32]，忽略掉了种质自身氮吸收利用效率，这样容易筛选出耐低氮能力强，但在正常氮条件下氮吸收利用效率低的品种。 因此，本研究在聚类热图分析的基础上，结合种质氮效率综合值，综合评价各种质的氮素吸收利用水平。

3.3 棉花耐低氮能力的苗期筛选与田间鉴定分析

筛选棉花耐低氮品种的最客观直接的方式是在缺氮和正常施氮的土壤上种植，以最终产量和品质进行评价；但庞大的筛选群体及田间全生育期试验增加了筛选难度，不仅耗时、费工和筛选效率低，而且土壤氮素的时空异质性、气候、病害等因素提高了试验的不可控性[33]。因此，许多研究在作物苗期进行氮效率差异种质的筛选，结果证实作物种质间氮效率相关指标在苗期表现出显著差异；因此，在苗期进行筛选是可行的[29]。产量是作物各性状综合作用的结果，可以初步表征氮效率，即在正常氮与低氮处理下产量均大于平均值的为氮高效基因型，反之则为氮低效基因型[34]。 苗期筛选可以控制环境条件，快速进行大批量的筛选， 但筛选条件与田间环境差异太大，首先表现在溶液氮素形态，无法真实反映植株利用土壤有效氮的能力。 因此，须对苗期快速筛选结果和田间全生育期筛选结果进行对比分析，确定苗期筛选的结果准确性和可行性。

4 结论

供试棉花种质苗期的总干物质质量等12 个指标在低氮和正常氮水平下均存在显著性差异。综合变异系数、主成分分析及相关性分析，将总干物质质量、地上部干物质质量、根干物质质量、总氮积累量、地上部氮积累量、氮吸收效率6 个性状作为棉花苗期氮效率评价指标。 利用聚类热图分析和氮效率综合值在苗期初步筛选，并进行田间试验以产量指标验证，最终确定鲁05R59 和中棉所69 为耐低氮、氮高效种质，珂字棉201 和新陆中30 号为低氮敏感、氮低效种质；同时证明利用上述6 个性状在苗期筛选是可行的，可用于耐低氮种质的初筛。