二至丸对绝经后骨质疏松鼠的作用观察及可能机制研究

2020-12-07姜宜妮梁健闵建新曾文泓

世界中医药 2020年21期

姜宜妮梁健闵建新曾文泓

摘要目的：观察二至丸对绝经后骨质疏松模型鼠的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。方法：将100只雌性SD鼠随机分为空白组（n=20）和造模组（n=80），造模组大鼠均接受双侧卵巢切除术致骨质疏松模型，将成模大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，造模12 h低剂量组、中剂量组及高剂量组分别予3、6、12 g/kg二至丸灌胃，1次/d。模型组与空白组均予1 mL生理盐水灌胃，连续干预8周，比较各组骨组织病理学、组织形态计量学、骨密度生物力、血脂代谢、组织Wnt/β-catenin通路标志性因子的改变。结果：与空白组比较，模型组脂肪细胞明显增大，脂肪细胞密度、面积、FLAW、PPARγ显著增加，外周血TC、TG和LDL-C含量上调（P<0.01）。与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量大鼠上述指标表达下调（P<0.05）;与空白组比较，模型组大鼠BV/TV、Tb.Th，Joint、骨密度、弹性模量、最大载荷、Wnt3a、β-catenin、LRP5表达均减少（P<0.05）;与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量组上述指标表达均显著增加（P<0.05）。结论：二至丸可明显改善骨质疏松症，其作用机制可能与激活Wnt/LRP5/β-catenin通路有關。

关键词骨质疏松;二至丸;不同剂量;作用机制;Wnt/LRP5/β-catenin通路

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of Erzhiwan on Postmenopausal Osteoporosis Rat Model and discuss the possible mechanism.Methods：A total of 100 female SD rats were randomly divided into blank group（n=20）and ovariectomy group（n=80），the rats of ovariectomy group were given bilateral ovariectomy to induce osteoporosis and randomly divided into model group（n=20），low-dose group（n=20），middle-dose group（n=20）and high-dose group（n=20）.About 12 h after modeling，the low-dose group，middle-dose group and high-dose group were given Erzhiwan 3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg by gastric perfusion per day.The rats of model group and blank group were given normal saline 1 mL by gavage.The rats were treated for 8 weeks.Bone histopathology，bone histomorphometry，biomechanics，blood lipid metabolism and changes of key factor of Wnt/β-cateni pathway were compared.Results：Compared with the blank group，fat cell hypertrophy，density of lipocyte，cell area，FLAW and PPARγ markedly increased，TC、TG and LDL-C in Peripheral blood were down regulated in model group（P<0.01）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Compared with the blank group，BV/TV，Tb.Th，Joint，bone mineral density，elastic modulus，maximum load and expressions of Wnt3a，β-catenin and LRP5 markedly decreased in model group（P<0.05）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Conclusion：Erzhiwan can prevent osteoporosis effectively，the mechanism may be related to the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords Osteoporosis; Erzhiwan; Different doses; Mechanism; Wnt/β-catenin signaling pathway

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.011

中医并无“绝经后骨质疏松”的病名记载，根据该病的病因病机及相关临床症状将其归于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范畴[1]。中医认为肾主骨生髓乃先天之本，《证治准绳》曰：“肾虚不能生肝，肝虚无以养筋，故机关不利”，由此可见“肝肾同源”下先后天之精血的互化及相互作用，共同介导骨骼疾病的转归[2]。二至丸是补益肝肾之良方，现代中医将其大量运用于治疗绝经后骨质疏松[3-5]，但其作用机制目前尚不明了，基于此我们利用大鼠模型，不同剂量二至丸进行干预，旨在探讨二至丸治疗绝经后骨质疏松的可能机制，为临床提供客观依据，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物雌性SD鼠[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号码：SYXK（湘）2016-0002）]100只，体质量（230±15）g，鼠龄（5±0.5）个月。所有大鼠均饲养于江西中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室中，许可证号为：SYXK（赣）2014-0008。大鼠接受同批次饲料喂养，饲养环境：温度（23±1）℃，湿度（50±2）%，昼夜12 h/12 h交替，干预操作均在下午14：00-17：00进行。

1.1.2 药物二至丸（雷允上药业有限公司;国药准字Z32020882）。

1.1.3 试剂与仪器水合氯醛溶液（广州沛瑜生物制品有限公司，货号：AAPR177-500），总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38293），三酰甘油（TG）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38222），低密度脂蛋白（LDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，貨号：19232），高密度脂蛋白（HDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：18723），Wnt3a一抗抗体（货号：23915），LRP5（货号：57315），DKK1（货号：46875），RUNX2（货号：12556s），β-catenin（货号：12475s），β-actin（货号：4970T）均购自美国CST公司。双能X线BMD仪（奥斯托公司，韩国，型号：EXA-3000），电泳制胶架（碧云天生物公司，货号：E6030），转膜系统（Bio-Rad公司，美国，货号：E1130），台式低温高速离心机（BECKMAN公司，美国，货号：64R），酶标自动分析仪（BIO-BAD公司，美国，型号：ELX800），精密电子万能材料试验机[大迈仪器（上海）有限公司，货号：AGS-J]，微计算机断层扫描设备（micro computed tomography，Micro-CT）（BRUKER microCT公司，德国，型号：SKY SCAN-1172）

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 100只大鼠数字随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，所有大鼠在体质量、鼠龄等方面差异无统计学意义（P>0.05），可进行组间比较。参考文献[6]中的模型制备方法：所有大鼠适应性喂养7 d，称重，用10%的水合氯醛溶液（0.2 mL/kg）腹腔内注射麻醉后固定动物于手术台上，常规无菌操作，于大鼠下腹部正中切开约1 cm的切口，逐层切开皮肤、皮下组织进入腹腔，行双侧卵巢切除术。先结扎输卵管与伴行血管再切除卵巢，同法处理对侧。最后，用10%青霉素溶液冲洗切口，逐层缝合。术后3 d每只大鼠臀肌注射青霉素[2万单位/（100 g·d）]预防感染。空白组大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合。

1.2.2 给药方法造模12 h后对大鼠进行药物干预，各组干预具体如下：1）二至丸低剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（3 g/kg），1次/d。2）二至丸中剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（6 g/kg），1次/d。3）二至丸高剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（12 g/kg），1次/d。4）模型组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，1 mL生理盐水灌胃对照观察。5）空白组：大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合，1 mL生理盐水灌胃对照观察。均连续干预8周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 各组骨组织病理学改变干预结束后各组随机选取3只大鼠，充分麻醉后处死，冰上取出右侧胫骨，将组织样本置于4%多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙42 d后，取大鼠右侧胫骨骨骺线下0.5 cm，进行密封脱水[乙醇I（100%），乙醇II（95%），乙醇III（90%），各1 h;乙醇IV（80%），乙醇V（75%），各50 min;乙醇VI（70%），45 min，二甲苯I，二甲苯II，各10 min;二甲苯III，20 min;石蜡I，50 min;石蜡II，1 h;石蜡III，90 min]、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm），45 ℃烤片2 h，随后置于倒置显微镜下观察骨组织病理学变化（骨髓脂肪细胞平均直径、密度，脂肪空泡面积）。

1.2.3.2 各组骨组织形态计量学变化利用microCT对各组大鼠右侧胫骨进行骨组织形态扫描，由此进行计量记录，从胫骨近心端骨垢线消失处开始扫描，直至胫骨远心端，扫描厚度10 μm，共扫描70层。应用全自动图像数字化分析仪对所得图片分析处理，记录单位体积骨小梁骨（BV/TV，1/4）、骨小梁平均宽度（Tb.Th）、骨小梁平均间距（FLAW）、骨小梁节点数（Joint）、相对类骨质量（OV/BV，1/4）、成骨细胞指数（OBI，个/mm）、矿化沉积率（MAR，m/d）、矿化延迟时间（MLT，d）、骨形成率（BFR，m/d）。

1.2.3.3 各组骨密度检测干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后处死，取右侧股骨，使用双能X线BMD仪（DXA）检测样本的BMD，将解冻后的骨样本整齐的摆放在检测床上开始检测，结果用g/cm2表示。

1.2.3.4 各组大鼠生物力学指标检测完BMD的股骨用AGS-J系列精密电子万能材料试验机检测最大载荷和弹性模量。具体方法：将股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为17 mm的2个支撑点上，压头大概在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下10 mm/min的载荷，直至股骨断裂，最后记录并计算最大载荷和弹性模量，股骨断裂前所能承受的最大力为最大载荷，股骨断裂时所承受的力为断裂载荷。

1.2.3.5 各组血脂代谢指标干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后取腹主动脉血，4 ℃，5 000 r/min，离心半径5 cm条件下离心10 min，取上清液利用全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.2.3.6 骨组织Wnt/β-catenin通路干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后处死，冰上快速取出右侧股骨，加入RIPA蛋白裂解液，匀浆机中匀浆30 min，将样本置于4 ℃，5 000 r/min，离心半径5 cm的条件下离心20 min，取上清液（总蛋白溶液），用BCA法进行蛋白浓度检测并得出各个样本上样量，并将样本加入电泳凝胶内进行跑胶，目的蛋白完全分离后转膜至PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉进行条带封闭，2 h后用TBST漂洗条带，术后加入Wnt3a、LRP5、DKK1、RUNX2、β-catenin一抗抗体（均按照1∶1 000比例稀释），4 ℃，孵育过夜，TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000稀释），室温下孵育2 h，再次用TBST漂洗条带1次，滴加ECL显影液发光显影，利用ImageJ软件分析蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料由（±s）表示，数据符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布采用秩和检验，多组采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组骨组织病理学改变与空白组比较，模型组脂肪细胞明显增大，脂肪细胞密度和面积显著增加（P<0.01）。与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量大鼠脂肪细胞明显减小，脂肪细胞密度和面积显著降低（P<0.01）。见表1，图1。

2.2 各组骨组织形态计量学变化与空白组比较，模型组大鼠BV/TV、Tb.Th，Joint均减少（P<0.05），FLAW明显增加（P<0.05）;与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量静力学参数BV/TV、Tb.Th，Joint均显著增加（P<0.05），而FLAW明显减少（P<0.05）。见表2。

2.3 各组骨密度及生物力学比较与空白组比较，模型组骨密度显著降低（P<0.05），与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量组大鼠BMD显著增高（P<0.01）;与空白组比较，模型组弹性模量、最大载荷显著降低（P<0.01），与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量大鼠弹性模量、最大载荷显著增高（P<0.01）。见图2，表3。

2.4 各组血脂代谢指标比较与空白组比较，模型组大鼠外周血TC、TG和LDL-C含量上调，HDL-C表达减少，差异均有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量TC、TG和LDL-C含量降低（P<0.05），HDL-C表达上调（P<0.05）。见表4。

2.5 各组骨组织Wnt/β-catenin通路改变与空白组比较，模型组Wnt3a、β-catenin、LRP5表达显著降低（P<0.05），二至丸中剂量组和高剂量Wnt3a、β-catenin、PPARγ表达明显上调（P<0.05）。见图3。

3 讨论

大量文献资料显示Wnt/β-catenin通路是刺激成骨细胞增殖、成骨分化，抑制其成脂分化的重要通路，Wnt3a是Wnt信号通路重要的因子，Wnt3a与细胞膜上受体卷曲蛋白（Frizzled）结合后启动该通路，由此将细胞内的蓬乱蛋白激活，促使其与体轴发育抑制因子产生互作效应，抑制了β-catenin的磷酸化，由此导致β-catenin大量堆积与胞质内，并移位至细胞核，进一步启动下游靶因子。LRP5是该通路重要的下游靶因子，可促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，激活细胞外基质磷酸化糖蛋白（MEPE）基因启动子，从而诱发细胞外基质（ECM）矿化的发生[7-10]。有数据显示在胚胎发育早期，随着Wnt/β-catenin通路被抑制BMSCs成脂分化的程度越明显，从而引起骨量下降和骨密度减少，导致骨质疏松等疾病的发生发展[11]。由此可见Wnt3a、β-catenin、LRP5是关键因子，该3个指标的表达高低是Wnt/β-catenin通路激活状态的直接体现。Wnt/β-catenin通路已然成为中医药领域学者研究骨质疏松的热点，其相关性亦被不断证实。PPARγ是调控脂代谢的重要因子，其在脂肪组织有高表达，是脂肪形成的核心基因，主要调控脂肪细胞分化过程[12]。LPL是介导脂代谢过程的活性酶，在PPARγ调控下LPL可将机体的三酰甘油分解成甘油及游离脂肪酸，有数据显示上调PPARγ的表达及活性可驱动成骨细胞发生成脂分化，随着Wnt/β-catenin信號通路被抑制，最终将进一步加剧骨质流失[13]，由此我们认为PPARγ即可促使成骨细胞成脂分化，亦可抑制其成骨分化，从而诱发骨质疏松的发生发展。LRP5是低密度脂蛋白受体，是调控成骨细胞分化的重要因子，LRP5是Wnt/β-catenin信号通路的辅助受体，LRP5的表达缺失可导致Wnt/β-catenin信号通路传导出现障碍，从而影响骨骼系统的调控。本研究中我们发现;模型组脂肪细胞明显增大，脂肪细胞密度、面积、FLAW显著增加，外周血TC、TG和LDL-C、LRP含量上调，BV/TV、Tb.Th，Joint、骨密度、弹性模量、最大载荷、Wnt3a、β-catenin、LRP5表达均减少。由此可见骨质疏松发生时骨密度下降，骨骼弹性、承载力下降，Wnt/β-catenin信号通路受抑制，由此我们认为上调LRP5表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制PPARγ将是有效改善骨质疏松的有效途径。

絕经后骨质疏松是女性常见疾病，归属于中医“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范畴。肾乃先天之本，主骨生髓，《医精经义》曰云：“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也，髓者，精之所生也，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强”，由此骨质的强健取决于肾精的盛衰[14-15]。《黄帝内经》亦云“年四十而阴气自半”。女性至更年期，肾气渐衰，精亏血少，则肾阴更显不足，如加之肝火、心火之暗耗，故围绝经期妇女以肾阴虚居多，因此补益肝肾是治疗绝经后骨质疏松的关键。二至丸由女贞子、墨旱莲2味药组成，以《医方集解》记载者为常用方，有益肝肾、补阴血、壮筋骨的疗效[16]，本研究将不同剂量的二至丸用于干预骨质疏松模型鼠，结果显示随着剂量的增加，二至丸在增加模型鼠骨密度，改善脂代谢方面疗效越显著，且随着浓度的增加，大鼠Wnt3a、β-catenin、LRP5表达越明显，PPARγ表达越下调。

由此我们认为6 g/kg和12 g/kg二至丸均可激活Wnt/β-catenin信号通路而抑制骨质疏松的发展，但是骨髓内微环境复杂多样，仅从一条通路探讨二至丸的作用机制尚不够全面，下阶段将进一步研究，深入探讨二至丸治疗骨质疏松的可能机制。

参考文献

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