噁喹酸在石斑鱼体内药代/药效动力学联合参数及防耐药给药方案

吴越，马建忠，胡园，许凯伦，周朝生

(浙江省海洋水产养殖研究所，浙江 温州 325005)

石斑鱼是鮨科(Serranidae)石斑鱼属鱼类的总称，其肉质鲜美、营养丰富，现已成继大黄鱼、鲆鱼和鲈鱼后的第四大类海水养殖品种。随着石斑鱼市场需求的日益上升，其养殖规模迅速扩大，养殖密度不断增加，养殖病害时有发生。哈维氏弧菌是引起石斑鱼发病的主要致病菌之一，可引发皮肤溃疡病、突眼症等疾病[1-2]，严重影响了养殖效益。目前水产养殖中控制哈维氏弧菌病最直接有效的手段是抗菌药物防治。

噁喹酸是第二代喹诺酮类抗菌药，有抗菌谱广、抑菌浓度低、抗菌效果明显等优点，我国农业部渔业局在农渔养[2000]17 号文件中推荐使用，为水产专用抗菌类药物，被广泛用于海水鱼类的细菌性疾病，尤其是弧菌病的治疗[3-4]。但现有国标及规范中关于噁喹酸用药方案和休药期较为笼统，缺乏针对具体品种水产动物的个体化用药方案。在水产养殖过程中盲目用药现象仍然普遍存在，这不仅会使水产品中的药残超标，更是容易导致病原微生物对抗菌药耐药性的不断增强。因此，在抗菌药物使用中制定既有良好的临床疗效，又能防止耐药突变菌株被选择性富集扩增的科学给药方案显得尤为重要。目前对于水产用抗菌药给药方案的制定大多基于对于药物在水产动物体内的药物代谢动力学(Pharmacokinetic，PK)的研究[5-6]，而对于防耐药方面很少涉及。防细菌耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC) 和耐药突变选择窗(mutant selection window，MSW)理论的提出为限制耐药突变菌株选择性扩增提供了新的思路。MPC 是指抑制细菌耐药突变体被选择性富集扩增所需的最小抗菌药物浓度，MSW指最小抑菌浓度(MIC)和MPC之间的浓度范围。当抗菌药物浓度维持在MPC之上时，MSW关闭，可限制耐药突变株的出现。本研究测定了噁喹酸对哈维氏弧菌的最小抑菌浓度及噁喹酸在石斑鱼体内的药物代谢规律，分析了药动学(Pharmacokinetic，PK)/药效学(Pharmacodynamic，PD)联合参数，并结合MPC和MSW理论，制定了噁喹酸在石斑鱼中的防耐药给药方案。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂

噁喹酸原粉浓度≥99.0%，乙腈、正己烷、甲酸等为HPLC级，噁喹酸标准物质≥98.0%，肝素钠(上海安谱实验科技股份有限公司)。无水硫酸钠(分析纯，温州金山化学试剂仪器公司)，650 ℃烘4 h后，保存于干燥器中。

1.2 主要仪器

Acquity UPLC超高效液相色谱配荧光检测器(Waters公司)；5810R离心机(eppendorf公司)；WD-12氮吹仪(上海安谱公司)；LRH-150F生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；ZHWY-2012恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.3 供试动物及菌株

健康石斑鱼150尾，平均体重(500±50)g，养于浙江省海洋水产养殖研究所洞头基地，养殖水温为(25±3)℃；随机抽取检测，未检出噁喹酸；养殖期间每天投喂不含噁喹酸的饲料。试验用哈维氏弧菌菌株H11由本单位前期从发病鱼体内分离鉴定并保存。

1.4 给药方式与剂量

噁喹酸注射用药液配置参考文献[7]。称取噁喹酸1.500 0 g，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶解，用6 mol·L-1盐酸调节pH至10.5，用0.9%氯化钠水溶液定容至100 mL，配成15 mg·mL-1的注射用药液，注射剂量分别为10、20、30 mg·kg-1，肌肉注射给药。

1.5 取样

在给药后0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12、24和48 h，取尾静脉血于含有1%肝素钠的离心管中，分离血浆。在给药后0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12、24、48、72、96、144、192、288、382和584 h，取肌肉组织。血样和肌肉组织均保存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.6 组织中噁喹酸的测定

肌肉前处理方法参考SC/T 3028—2006[8]标准中样品制备的操作步骤。血样前处理方法参考文献[9]。取样品1 mL，置于25 mL离心管中，加入干燥的乙酸乙酯液20 mL，无水硫酸钠1 g，超声提取5 min。于3 000 r·min-1离心10 min，上清液转入50 mL茄形瓶中。于50～55 ℃下旋转蒸发至近干，马上加入1 mL流动相溶解，再加入1 mL正己烷于漩涡混合器上充分振荡，转入5 mL离心管中，于3 000 r·min-1离心5 min，取下层清液，用滤器过滤至进样瓶中。

色谱条件。色谱柱为安捷伦C18；流动相为1%甲酸水溶液-乙腈(70+30)；流速1.0 mL·min-1，检测器波长：激发波长312 nm，发射波长366 nm，进样量50 μL。

2 结果与分析

2.1 体外药效

噁喹酸对哈维氏弧菌H11菌株的MIC为1.0 mg·L-1，MBC为2.0 mg·L-1。将浓度为1、2和4 MIC的噁喹酸药液与H11菌株菌悬液接触1 h后，PAE分别为(1.97±0．05)、(2.54±0.12)、(2.79±0.08)h。结果发现，在1～4 MIC，随着药物浓度的升高，PAE时间延长，表明噁喹酸对菌株的PAE呈现出一定的浓度依赖性。对照组C1与药物残留对照组C2中细菌生长曲线基本保持一致，说明400倍稀释可去除药物(图1)。噁喹酸对H11的MPC为4.0 mg·L-1，MSW范围为1～4.0 mg·L-1，表明当噁喹酸浓度在1～4 mg·L-1的范围时，细菌耐药突变株可能被选择性富集扩增；当药物浓度高于防耐药突变浓度4.0 mg·L-1时，即可减少耐药突变菌株的发生概率，又可达到理想的杀菌效果。

图1 噁喹酸对菌株H11的抗生素效应

2.2 不同剂量噁喹酸在石斑鱼血浆中的代谢规律

分别对石斑鱼进行10、20、30 mg·kg-1体质量剂量的噁喹酸给药后在各时间点采样，经高效液相色谱检测血浆中噁喹酸浓度并拟合药时曲线(图2)。结果发现，3组剂量的噁喹酸在石斑鱼血浆中的变化规律基本一致，都在0.5 h就已达到峰值，之后呈下降趋势，且速度较快。随着给药剂量的升高，药物在血浆中的含量也升高。

图2 不同给药剂量下石斑鱼血浆中噁喹酸的药时曲线

2.3 不同剂量噁喹酸在石斑鱼血浆中的药物代谢动力学分析

将不同给药剂量下噁喹酸在石斑鱼血浆中的药时数据通过药代动力学软件winNonln5.2.1进行房室模型拟合，表1结果表明，噁喹酸在石斑鱼血浆中的药时数据均符合一级吸收二室模型。

表1 不同剂量噁喹酸在石斑鱼血浆中的药动学方程

表2显示，随着给药剂量浓度的升高，药时曲线下面积和消除半衰期均升高，消除速率降低。药动学方程为给药方案的制定提供了理论参考，药物代谢动力学参数尤其是AUC24、Cmax和Tmax等是制定给药方案的重要参数。

表2 不同剂量噁喹酸在石斑鱼血浆中药动学参数

2.4 药代/药效动力学联合参数研究

由图3可知，结合噁喹酸对哈维氏弧菌H11的体外药效和在鱼体内药动学结果发现，10、20、30 mg·kg-1剂量的噁喹酸给药后，AUC24/MIC分别为61.862 8、135.964 7和199.113 9；Cmax/MIC分别为10.859、13.870和17.817；血浆药物浓度大于MPC的维持时间分别为3、24、36 h。研究表明，AUC24/MIC、Cmax/MIC是预测抗菌药物疗效的重要参数，当AUC24/MIC≥125或Cmax/MIC>8时，可获得良好的临床疗效。本研究中20和30 mg·kg-1剂量下均满足AUC24/MIC≥125及Cmax/MIC>8的要求，且血药浓度大于MPC时间均维持在24 h以上，因此，确定最佳的给药剂量为20 mg·kg-1，每日给药1次，根据疗效可连续给药几日。

图3 不同剂量噁喹酸在石斑鱼血浆中不同时间的药物浓度与MIC、MPC及MSW的关系

2.5 休药期的确定

本研究将肌肉作为药物残留的检测组织，参考日本肯定列表中噁喹酸残留限量(MRL)0.05 mg·kg-1，以已确定的给药剂量20 mg·kg-1计算休药期。分析药物代谢规律发现，在给药12 d后，肌肉中噁喹酸含量为(0.057±0.014)mg·kg-1，在给药16 d后，肌肉中噁喹酸含量为(0.007±0.002)mg·kg-1，因此，建议石斑鱼中噁喹酸休药期为16 d。

3 讨论

本试验开展了噁喹酸对哈维氏弧菌的体外药效学及其在石斑鱼体内的药代动力学研究。药效学结果显示，噁喹酸对本研究中哈维氏弧菌的MIC值为1 mg·L-1。王元等[10]分析了噁喹酸对132株弧菌的MIC值分布于0.15～1.25 mg·L-1，与本研究中噁喹酸的MIC值较为一致，表明噁喹酸对弧菌有较好的抑菌效果。李健等[4]研究发现，噁喹酸对海水养殖动物中哈维氏弧菌、溶藻弧菌、坎贝氏弧菌和副溶血弧菌以及淡水嗜水气单胞菌均有明显的抑菌效果。因此，在石斑鱼养殖中可以考虑选择噁喹酸来治疗弧菌引发的病害。

药动学分析发现，肌肉注射给药后噁喹酸在石斑鱼体内的代谢符合一级吸收二室模型。梁增辉等[7]通过血液注射给药后发现噁喹酸在鳗鱼体内符合一级消除二室模型。而林丽聪等[11]研究表明，口灌给药后噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的代谢动力学符合一级吸收一室开放模型，浸浴给药方式下噁喹酸经时过程则符合一级吸收二室开放模型。以上研究结果表明，种属间差异和给药方式不同都会影响噁喹酸的代谢规律。血药Cmax、Tmax和AUC是反映药物在体内吸收快慢程度和评价体内药效的重要指标，而消除半衰期(t1/2β)是评价药物消除快慢的重要参数。关于噁喹酸的药物代谢动力学研究主要集中于鱼类中。Rigos G等通过10 mg·kg-1剂量血管注射给药噁喹酸后分析其在金头鲷体内的药物代谢动力学[12]，Cmax为(11.617±3.013) mg·L-1，Tmax为0.5 h，t1/2β为10.71 h，与本试验结果较为相似，AUC为53.5 mg·h·L-1，比在石斑鱼中小。孙爱荣[13]研究了24.5 ℃水温下以10 mg·kg-1剂量单次静注噁喹酸后大菱鲆中的药代动力学，其Cmax为18.89 mg·L-1，AUC72为99.069 mg·h·L-1，与本试验结果也较为相似，Tmax为0.083 h，达峰时间早于石斑鱼，t1/2β为24.441 h，其消除速度明显小于石斑鱼[13]。孙朋辉等[14]研究了25 ℃水温下口灌20、30、40 mg·kg-1剂量噁喹酸后在异育银鲫体内药代动力学，Cmax为4.1～8.87 mg·L-1，Tmax均为1 h，AUC24为21.624 1～39.184 6 mg·L-1。由此可见，受试品种和给药方式对噁喹酸的吸收与消除有影响。噁喹酸以肌肉注射给药石斑鱼后在鱼体内的吸收效果较好，与一些鱼类品种静脉注射的结果较为相近，而消除速度可能比静脉注射要慢，有助于血药浓度保持在一个较高的水平。

在制定抗菌药物给药方案时，需要综合考虑药物对致病菌的体外药效以及药物在动物体内的药代动力学特征。研究认为，喹诺酮类药物对革兰阴性菌的0～24 h内药—时曲线下面积/最小抑菌质量浓度为100～125时或Cmax/MIC>8，有良好的临床疗效[15-17]。但传统的通过药效学/药代学联合参数制定给药方案时往往仅考虑AUC24/MIC、Cmax/MIC和T>MIC等预测药物临床疗效的指标，而这种给药方案中并未涉及预防耐药菌株的产生。在水产养殖行业中抗菌药物滥用现象普遍存在，细菌耐药性情况日趋严峻，已经成为研究热点问题。MPC、MSW理论的提出弥补了传统药效学/药代学联合参数未考虑限制致病菌产生耐药性的不足之处。当抗菌药物浓度处于MSW内时，细菌耐药突变株可能被选择性富集扩增，但当抗菌药物浓度高于MPC时耐药株的富集就会被抑制。已有MPC和MSW在水产养殖用药中的相关研究。李梦影等[18]根据AUC24/MIC>125或Cmax/MIC>8～10标准，综合血药浓度维持MPC以上的时间超过(24-PAE)h，确定了氟苯尼考防治嗜水气单胞菌引起的鲫和草鱼细菌性败血症的给药方案。徐丽娟等[19]利用MPC和MSW 理论并结合药代动力学(PK)参数，制定了恩诺沙星防耐药突变用药方案控制由嗜水气单胞菌引起的鲫细菌性败血症。本研究中20和30 mg·kg-1剂量下均满足AUC24/MIC>125及Cmax/MIC>10的要求，且血药浓度>MPC的持续时间分别为24和36 h。体外药效试验结果显示，在MPC浓度下，噁喹酸对哈维氏弧菌的PAE持续2.79 h以上。因此，在20 mg·kg-1剂量下，血药浓度>MPC发挥抗菌疗效的时间已经完全可以达到(24-PAE) h以上。由此建议，在控制石斑鱼哈维氏弧菌感染时，采用20 mg·kg-1的肌肉注射给药剂量，给药间隔时间为24 h，既可获得良好的疗效，又可预防耐药菌的出现。