一株产蛋白酶海洋细菌的分离鉴定及发酵条件研究

金楚杰，吴津，郭伟鑫，劳吴荣，杨鸿，李鹏

(浙江海洋大学 海洋科学与技术学院，浙江 舟山 316022)

蛋白酶(protease)是重要的工业酶，常存在于微生物及动、植物中，其应用广泛，在食品、环保、丝绸、医药、饲料、制革、洗涤剂、饲料等领域都有广泛应用[1-3]。目前对于海洋来源的碱性蛋白酶研究主要集中在筛选新型碱性蛋白酶和产酶菌株，近几年有研究报导了一些具有较高pH适应性的海洋来源的菌株[4-6]。海洋微生物处在低温、高压、高盐等的极端环境中，其代谢产物与陆生微生物相比结构更加新颖，更适合用于极端条件。Sreeja等[7]从海洋细菌株EngyodontiumalbumBTMFS10中分离到碱性丝氨酸蛋白酶，该酶在部分有机溶剂和表面活性剂中均具有良好的稳定性，具有耐高温、高pH值的特点。Anjali等[8]从海洋细菌BacillustequilensisP15的代谢产物中分离到碱性蛋白酶，实验结果显示该酶在制革、丝绸方面都具有很好的应用前景。

舟山海域具有丰富的海产资源，水产品加工企业较多，鱼虾蟹贝类等的加工下脚料利用率较低，从下脚料中筛选出具有高酶活性的产蛋白酶海洋细菌，并应用于饲料行业，具有很好的研究前景。本研究筛选来源于下脚料的产蛋白酶海洋细菌，对其进行初步研究，并为下一步在基因克隆等方面打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

购买并收集舟山本地兴业集团的水产品下脚料，装于无菌采集瓶，置于4 ℃冰箱，并尽快处理。

1.2 培养基

脱脂奶培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂20.0 g，溶解于1 L海水中，调节pH值为7.2～7.4，121 ℃高压灭菌20 min。脱脂牛奶10.0 g，溶于1 L海水中，115 ℃高压灭菌30 min。于超净工作台混匀备用。

种子培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，溶解于1 L海水中，121 ℃高压灭菌20 min。

发酵培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脱脂奶10.0 g，溶解于海水1 000 mL，pH 8.5，115 ℃高压灭菌30 min。

1.3 菌株的分离和筛选

取10 g下脚料，用组织捣碎机粉碎后置于加入90 mL无菌水的三角烧瓶中(内装玻璃珠)，摇床震荡30 min充分混匀，进行梯度稀释，即取0.5 mL样品加入装4.5 mL无菌水的试管中，即得样品浓度为10-2，依次制备10-3～10-6浓度，取10-4～10-6样品0.1 mL涂布于脱脂奶培养基中，每个浓度至少做9个重复，28 ℃倒置培养2～3 d，待菌落生长后观察有无透明圈产生，挑取周边有透明圈的菌落进行划线(脱脂奶平板中)，重复3次，得到纯菌株。

1.4 蛋白酶活性的测定

将筛选到的菌株接种于种子培养基，28 ℃，120 r·min-1，培养20 h，取1 mL种子液接种于发酵培养基，装瓶量50/250 mL，28 ℃，120 r·min-1，培养48 h后，5 000 r·min-1离心，取上清粗酶液，利用Folin-酚法进行酶活测定。

蛋白酶活力：以酪蛋白为底物，每分钟水解产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.5 菌株的分子鉴定

由天根生化科技(北京)有限公司提供试剂盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)提取染色体DNA，利用通用引物进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，后利用产物纯化试剂盒回收，回收的DNA进行测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司进行。测序得到的序列，上传BLAST进行比对，比对结果采用MEGA 4.0的邻接方法构建系统发育树[9-11]。

1.6 单因素实验

将斜面保种纯菌株，先用种子培养基进行活化，按照接种量5%分别接入发酵培养基中，进行单因素实验。分别取培养时间24、36、48、60、72 h的发酵液，NaCl浓度为1 g·L-1，初始pH 7.5，发酵温度为30 ℃，进行酶活的测定；分别调整发酵液的初始pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培养48 h，培养温度为30 ℃，NaCl浓度为1 g·L-1，测酶活；分别调整1 L发酵液中NaCl的含量5、15、25、35、45 g，培养48 h，培养温度为30 ℃，培养时间48 h，初始pH 7.5，测酶活；培养温度分别在25、30、35、40、45、50 ℃，培养时间为48 h，初始pH 7.5，培养时间48 h，NaCl浓度为1 g·L-1，测酶活。

1.7 BBD响应面分析法

利用Box-Behnken(Design-expert 10.0 USA)对影响酶活的3个最主要因素进行观察，进行培养条件最优化设计，确定最佳实验条件，并进行实验验证，确定精确度。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

脱脂平板筛选结果显示，从鱼虾蟹等下脚料中筛选到一株有较大透明圈的海洋蛋白酶生产细菌菌株，菌落在脱脂平板中产黑棕色色素，产生的透明圈较大，透明圈直径/菌落直径为3.8(图1)。

图1 脱脂平板的筛选结果

2.2 酶活测定

先绘制酪氨酸标准曲线，曲线如图2所示，其中R2=0.997 4，曲线表现出较好的线性相关性。利用Folin-酚法进行酶活测定，将测试的样品吸光值带入公式，重复实验2次，取平均值，得到最终的粗酶活性为88.6 U·mL-1。

图2 酪氨酸的标准曲线

2.3 菌株鉴定

PCR扩增产物的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司进行，将序列上传至NCBI的BLAST进行比对，后用MEGA 5.0的邻接(N-J)方法构建系统发育树(图3)，并将序列上传至GenBank，获得菌株的登录号为MK053886。该菌株与BacillscereusHFBP18、BacillscereusATCC 141579等菌株在进化关系上最近，相似性达到100%，菌株SP1属于蜡样芽胞杆菌Bacillscereus，因此，命名菌株SP1为BacillscereusSP1。

图3 菌株SP1的系统发育树

2.4 单因素实验

分别观察不同培养时间(24、36、48、60、72 h)、不同初始pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、不同NaCl浓度(5、15、25、35、45 g·L-1)以及不同培养温度(25、30、35、40、45、50 ℃)的酶活变化曲线，结果如图4所示。

单因素实验结果显示，在培养时间为48 h、pH在7.0～8.5、NaCl浓度25 g·L-1、培养温度40 ℃时，菌株的酶活性最强，酶活的曲线均表现为先升高再降低。同时在NaCl浓度为45 g·L-1时也表现出较好的酶活，说明该菌株具有较好的盐度耐受性。

2.5 BBD响应面设计优化培养条件

为了优化培养条件，选择3个关键因素A培养温度、B初始pH值、CNaCl浓度，采用Design-Expert 10.0软件响应面设计中的Box-Behnken方法进行优化设计(表1)。其中以酶活作为响应值，设计17组实验进行优化设计。

将3个因素进行组合，得到一个17次实验结果，输入Design-Expert 10.0软件，得到相应的二次方回归方程，其中Y表示响应值。

Y=92.4-7.51A-7.00B-8.59C+4.45AB+4.97AC-4.35BC-17.89A2-9.06B2-5.09C2。

对实验结果进行方差及显著性的分析，模型的P值<0.000 1，说明该模型显著。分析结果显示，因素A、B、C3个因素的P值分别为0.000 2、0.000 2及<0.000 1，均<0.05，表明该3个因素均影响显著。失拟项的F值是0.77，意味着缺乏拟合相对于纯误差不显著，“Adeq Precision”表示该模型的精密度，用于测试信噪比，当模型的“Adeq Precision”值≥4时，表明该设计模型符合要求。分析结果显示此次模型的“Adeq Precision”值为16.67，充分说明该模型设计符合对三因素的优化。

图4 单因素对酶活的影响

表1 3种因素水平及对酶活的影响

关于3个因素之间交互影响的结果，如图5所示。从图中可以看出，3个因素中B、C的交互影响最小，从显著性分析也可以看出B、C的P值最大，为0.019 8，在设计培养条件时，应该优先考虑P值最小的两因素之间的交互作用，该模型结合显著性分析显示A和C之间的交互影响最大，A、C的P值为0.010 9，因素A和C直接交互作用的3D和等高线图，如保持NaCl浓度不变，蛋白酶活性随着温度升高，后快速下降，在优化培养条件时，应优先考虑NaCl浓度对酶活的影响。

图5 3种因素对功率密度交互影响的三维曲面和等高线

求导回归方程，得到三因素的真实值分别为A=35.7 ℃；B=7.7；C=1.07 g·L-1，此时的酶活为97.65 U·mL-1。重新调整培养条件为培养温度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl浓度为20.7 g·L-1、培养时间48 h，摇床转速120 r·min-1，5%的接种量，实际酶活为101.8 U·mL-1，比优化前的酶活88.6 U·mL-1提高了14.9%，预测精度达到95.8%，同时也证明采用响应面BBD法进行优化设计的可行性。

3 小结与讨论

从舟山海水加工厂废弃鱼虾蟹等下脚料中分离筛选到一株产碱性蛋白酶的海洋细菌，使用Folin-酚法进行酶活测定，初始酶活为88.6 U·mL-1，利用16S rDNA进行分子鉴定，绘制系统进化树。进化树结果显示该菌株属于蜡样芽胞杆菌，并命名为BacillscereusSP1。单因素实验结果显示，在培养时间48 h、初始pH 8.5、NaCl浓度25 g·L-1、培养温度40 ℃时对应的酶活性最高。Box-Behnken Design方法进行响应面分析，优化设计培养条件，结果表明,培养温度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl浓度为20.7 g·L-1、培养时间48 h，摇床转速120 r·min-1，5%的接种量，实际酶活为101.8 U·mL-1，比优化前的酶活提高了14.9%，预测精度达到95.8%。

目前，产蛋白酶的微生物的研究主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、黄杆菌属(Flavobacterium)等[12-14]。蛋白酶是一类在碱性pH值范围时，能高效水解蛋白质的一类酶，其分子量大概在26 000～34 000 Da，大部分蛋白酶具有丝氨酸活性中心，并具有很强的底物特异性[15]。研究具有特殊性能的碱性蛋白酶以及蛋白酶工程菌是目前的热点[16]，K. Adinarayana等[17]研究发现，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在60 ℃环境中仍具有较好的酶活稳定性能。冯清平等[18-19]筛选到一株嗜碱性的地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis53-A6，经过选育，获得了一株高产碱性蛋白酶的菌株。刘成圣等[20]从海洋弧菌Vibrio pacini X4B-7的发酵液中获得产碱性蛋白酶，研究发现该酶对DNA酶具有专一地降解作用。

海洋的低温、高压、高盐等极端环境，导致海洋微生物具有别于陆生微生物的不同代谢途径，其代谢产物的结构往往更加新颖，更适合用于极端条件的研究。本研究获得的来源于鱼虾蟹下脚料中的海洋产蛋白酶细菌，为更好利用海洋资源，构造高产蛋白酶工程菌提供一定的研究基础。