桃细菌性穿孔病病原鉴定

赵文静，纪兆林，葛金涛，缪美华，刘兴满*

(1.连云港市农业科学院，江苏 连云港 222000； 2.扬州大学，江苏 扬州 225000)

桃树在我国已有3000年的栽培历史，在《齐民要术》上就有关于桃树生长特性、繁殖特点、栽培技术的详尽记载[1-2]。随着科技的发展，人们在栽培和管理桃树方面有了长足的进步。

桃树是连云港市栽培数量较多的一种果树，根据连云港市自然资源与规划局的统计，在2018年连云港地区桃园面积达5 000 hm2左右。随着果园管理的日益规范和对桃树种植经济价值的追求，果农们对桃树上出现的病害也越发关注。近几年，连云港地区桃细菌性穿孔病的爆发日益频繁，严重为害了桃树叶片和果实，给果农造成巨大的经济损失。

本研究采集了连云港市桃园中出现的桃穿孔病病样，采用形态特征和 16S-23SrDNAITS分子鉴定方法进行病原鉴定。病原菌研究结果表明，引起连云港地区桃细菌性穿孔病的病原为树生黄单胞菌李致病变种Xanthomonasarboricolapv.pruni(Xap)(异名：Xanthomonascampestrispv.pruni，Xanthomonaspruni)，本研究旨在为连云港市的桃细菌性穿孔病的预防和病原鉴定提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病害样本采集

2019年7月于连云港班庄镇桃树种植园中采集具有典型病害症状的桃树穿孔病叶，记录其为害症状特点。

1.2 病原菌的分离、纯化与保存

采用组织分离法进行病原菌分离[3]。首先用清水将病样表面冲洗干净、晾干，然后用刀片取病叶病健交界处组织数块2 mm见方，接着将病样组织浸渍于0.5%的次氯酸钠溶液消毒1 min，再用无菌水冲洗2～3次，随后浸渍在少量无菌水里，用灭菌玻棒捣烂，使组织内细菌溢出。最后用接菌环蘸取菌液在NA平板划线后将平板倒置于28 ℃培养箱中培养，待菌落长出后，用接菌环挑取单菌落进行划线纯化，如此重复纯化3～4次。

取纯化后新鲜的单菌落于NB试管中，于180 r·min-1、28 ℃过夜摇菌，取1 mL菌液离心去上清，然后沉淀加入200 μL 20%的甘油混匀，-80 ℃保存。

1.3 病菌种类鉴定

1.3.1 形态特征观察

观察分离菌株在NA平板上的菌落形态、颜色及色素产生等情况，并拍照记录菌落形态特征。

1.3.2 分子生物学鉴定

DNA提取。将保存的菌株在NA平板上活化，蘸取新生长的单菌落于NB试管中，于180 r·min-1、28 ℃下过夜摇菌，之后参照生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌的DNA，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测gDNA的质量，于-20 ℃下保存。

16S-23S ITS序列扩增。以病原菌的gDNA为模板，采用细菌通用引物16S-23S ITS序列进行PCR扩增，引物序列如下：ITS-f：5′-AGTCGTAACAAC GTAGCCGT-3′；ITS-r：5′-GTGCCAAGGCATCCAC C-3′。采用50 μL PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS-f/ITS-r(10 μM)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min，并于4 ℃终止反应。取6 μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，合格后送往公司测序。将测序病原菌rDNA-16S-23S ITS的序列在Gen-Bank数据库中进行BLAST比对，筛选与分离菌株相似度较高的同源DNA序列。

2 结果与分析

2.1 病害症状

桃细菌性穿孔病主要为害桃树的叶片和果实。在病害初期主要是在侵染叶片，先在叶片上形成水渍状斑点，随后病部组织逐渐坏死形成褐色病斑，病斑慢慢干枯脱落，形成叶片穿孔症状，病情严重时病斑接连成片，造成叶片大量脱落，引起树势衰弱(图1)。同时，桃细菌性穿孔病菌也会在桃果实上形成病斑，初时为淡褐色水渍状小圆斑且病斑边缘有黄绿色晕圈，随后病斑逐渐扩大，严重时病斑接连，造成果实凹裂，天气潮湿时，还易产生含菌脓的黏质分泌物等，造成果树极大的减产。

图1 桃细菌性穿孔病病叶

2.2 病原菌形态

将保存的病原菌纯化2～3次后，观察到菌体菌落呈淡黄色、湿润、黏稠、饱满的状态(图2)。

图2 桃细菌性穿孔病菌纯化后形态

2.3 病原菌16S-23S ITS序列分析

本研究以3个分离菌DNA为模板，采用细菌通用引物16S-23S ITS序列对这3个分离菌株L-1、L-2和L-3进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得3条600 bp大小的清晰条带(图3)。将扩增产物送公司测序，通过测序结果和BLAST同源比对分析发现，3株分离株的16S-23S rDNA ITS序列与Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，达95%以上，从而初步支持这3株分离菌株为树生黄单胞菌李致病变种(Xanthomonasarboricolapv.pruni)。

图3 基于16S-23S rDNA ITS序列部分菌株扩增凝胶电泳

3 小结与讨论

通过病害形态观察和分子生物学方法，观察病害的病部症状、菌株形态，同时比对分析分离株的扩增产物发现，分离株与Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，初步鉴定为Xanthomonasarboricolapv.pruni。

通过对致病菌Xanthomonasarboricolapv.pruni的文献检索发现，早在1903年北美就首次报道了该病原能够侵染日本李子[4]；70年代中期，意大利东北部爆发桃细菌性穿孔病，造成严重的经济损失[5]；2014年阿拉贡地区同样爆发该病害，造成杏仁的大减产[6]。之后在日本、法国、德国、俄罗斯、西班牙、瑞士等国家也陆续有该病原的报道[7]。由于该病害给果园带来巨大减产，造成严重的经济损失，欧盟和EPPO等地区已决定将Xap列为检疫性病原物[8-10]。

通过观察该病害的发生与流行发现，该病害一般在5月初就出现症状，在高温多雨的6—8月病情较重，即病情的发生严重程度可能与降雨量、湿度、温度都有一定的相关性。为有效地防控桃细菌性穿孔病，将在其生物学特性、发生规律、传播途径和防控技术等方面做进一步研究。