狗尾草叶瘟病病原的分子鉴定及其对14 种杀菌剂的敏感性测定

周锋，范玉闯，马亚辉，王金叶，胡明城，张明慧，翟凤艳，刘鸣韬，张伟丽，杨蕊*

（1.河南科技学院资源与环境学院， 河南 新乡 453003；2.范县农业农村局，河南 范县 457500）

狗尾草（Setaria viridis） 又称绿狗尾草、谷莠子，为单子叶植物纲禾本科黍亚科狗尾草属植物，常分布在热带和亚热带地区[1，2]。狗尾草富含酚类和多糖类物质以及钙和磷等矿质元素，且具有清热利湿、解毒等功效，是重要的中药资源[2～6]；同时，其具有易种植、植株较矮小、生长周期较短、二倍体、基因组较小、抗性基因丰富且较容易转化等特点，是研究单子叶植物基因功能的重要模式植物[1，7～9]。但是，狗尾草由于常伴生在玉米、大豆等主要农作物田中，因此被列为主要的农田杂草[10]。目前，关于狗尾草病原方面的报道主要集中在链格孢属（Alternaria spp.）、甘蔗平脐蠕孢菌（Bipolaris sacchari）、狗尾草平脐蠕孢（B. setariae）、间隔弯孢（Curvularia intermedia） 和嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratum） 等[10]，其他病原菌方面的研究尚未见报道；而且，对已报道的相关病原菌鉴定主要集中在形态学方面，对分子鉴定方面的内容涉及较少。

2019 年9 月作者在河南省新乡市郊区开展作物病害调研过程中发现，部分玉米田边生长的狗尾草叶片上存在很多形状为梭形、长椭圆形或椭圆形且边缘呈灰白色、中央呈暗褐色的病斑（图1），该症状与水稻叶瘟病比较相似[11]。为了进一步明确该病害的病原，对病原物进行了分离、纯化以及rDNA-ITS 的分子鉴定，同时测定了病原菌对14 种杀菌剂的敏感性，以期为该病害的化学防控提供指导。

图1 狗尾草叶瘟病的田间症状Fig.1 Field symptoms of leaf blast of green bristlegrass

1 材料与方法

1.1 试验材料

狗尾草感病叶片，取自田间已发病的植株上。

试剂有PDA 培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g，dd H2O 定容至1 L）、2×Taq master mix（北京康为世纪生物科技有限公司） 和DNA Marker 2000 （北京博迈德基因技术有限公司）。

杀菌剂有14 种，分别是96.0%咯菌腈原药（湖北健源化工有限公司）、97.0%咪鲜胺原药（湖北康宝泰精细化工有限公司）、95.0%氟啶胺原药（浙江禾本科技有限公司）、96.2%戊唑醇原药（江苏黄海农药化工有限公司）、97.5%吡唑醚菌酯原药（湖北康宝泰精细化工有限公司）、95.0%苯醚甲环唑原药（湖北健源化工有限公司）、96.6%醚菌酯（江苏耕耘化学有限公司）、98.0%腐霉利原药（浙江禾益农化有限公司）、95.0%氟吡菌酰胺原药（湖北康宝泰精细化工有限公司）、96.0%嘧菌酯原药（江苏耕耘化学有限公司）、97.0%啶酰菌胺原药（湖北康宝泰精细化工有限公司）、96.2%菌核净原药（浙江温州农药厂）、98.1%嘧菌环胺原药（湖北康宝泰精细化工有限公司） 和98.1%多菌灵原药（天津津北精细化工有限公司）。制备100 μg/mL 药剂母液，除96.2%菌核净原药用甲醇（分析纯） 溶解、98.1%多菌灵原药用0.1 mmol/L 稀盐酸溶解外，其他原药均用丙酮（分析纯） 溶解。

仪器设备有SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（浙江苏净净化设备有限公司）、HVA-85 型全自动高压蒸汽灭菌器（日本HIRAYAMA 公司）、HP2500G 型智能光照培养箱（金坛市瑞华实验仪器厂）、BSA124S电子天平〔赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司〕、2720 型PCR 扩增仪（美国Applied Biosystems 公司），DYY-7C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）、Tanon3500核酸凝胶成像系统（上海天能科技有限公司） 和CX31-RBSFA 型生物显微镜（Olympus Corporation）。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离 病原菌分离采用组织分离法[12]，稍有改动。取表现出明显症状的狗尾草叶片，在无菌条件下，将病健交界处剪成面积2～3 mm2的小块，分别用5%次氯酸钠溶液、70%酒精各润洗1 min，再用无菌水冲洗3 次，在超净台内晾干后放到PDA 培养基中央，用封口膜封口，倒置于23 ℃普通光照培养箱中培养。15 d 后挑选培养基上的孢子，在生物显微镜下镜检。其分生孢子为无色或淡褐色，洋梨形，顶部细胞立锥状，基部细胞钝圆，有凸起的脚胞，一般为2 个隔膜。

1.2.2 病原菌rDNA-ITS 的分子鉴定 采用罗中钦等[13]方法制备模板DNA，以ITS1 （TCCGTAGGTGAACCTGCGG） /ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC） 为 引 物〔由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成〕，对病原菌rDNA-ITS 进行PCR 扩增。50 μL PCR 反应体系包括：2×ES taq master mix 25 μg/mL，引物Ⅰ2 μg/mL，引物Ⅱ2 μg/mL，模板5 μg/mL，dd H2O 16 μg/mL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min （循环30 次），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，备用。对PCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。并对检测后有明显条带的PCR产物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司进行双向测序，再用DNAMAN 软件对测序反馈回来的序列进行初步分析，并将其与GeneBank 中下载的相关序列进行比对分析。

1.2.3 杀菌剂室内毒力测定 杀菌剂室内毒力测定参照室内生长速率法[14]，有改动。在洁净的工作台上用无菌水稀释母液，配制成含不同浓度药液的PDA 培养基平板，其中，将多菌灵母液分别稀释成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 和12.8 μg/mL 的溶液，其他药剂母液均分别稀释成0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的溶液，以加无菌水处理作为对照。在每个平板中央接入1 个直径6 mm的新鲜菌饼，每处理均设3 次重复。在23 ℃培养箱内培养48 h，采用十字交叉法测量菌落直径，取其平均值。计算生长抑制率和EC50，得到毒力回归方程。

1.3 数据处理与分析

采用DPS 软件（专业版） 对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌rDNA-ITS 序列扩增与序列分析

对狗尾草叶瘟病菌的rDNA-ITS 序列进行PCR 扩增，然后将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到了1 条明亮的条带（图2），测序得到长度为513 bp的DNA 片段。在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，该序列与已报到菌株Pyricularia oryzae （ID：JF414840.1）的序列高度相似，序列相似性为99.00%，鉴定该菌株属无性真菌类梨孢属成员。

2.2 杀菌剂对病原菌的室内毒力

图2 狗尾草叶瘟病菌rDNA-ITS 序列扩增产物凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of leaf blast pathogen of green bristlegrass

供试14 种杀菌剂中，多菌灵的EC50最高，为3.219 6 μg/mL （表1），说明狗尾草叶瘟病菌已经对多菌灵产生了较低水平的抗药性，用常规剂量已不能完全防除狗尾草叶瘟病的为害；其他13 种杀菌剂对狗尾草叶瘟病菌均具有较高活性，EC50为0.006 7～0.655 9 μg/mL，抑菌活性顺序为嘧菌环胺＞咯菌腈＞咪鲜胺＞氟碇胺＞戊唑醇＞吡唑醚菌酯＞苯醚甲环唑＞醚菌酯＞腐霉利＞氟吡菌酰胺＞嘧菌酯＞啶酰菌胺＞菌核净，表明这13 种杀菌剂均可以作为化学防治狗尾草叶瘟病病菌的候选药剂，其中嘧菌环胺的抑菌活性最高、菌核净的相对抑菌活性较弱。

3 结论与讨论

通过分子生物学技术对分离到的狗尾草叶瘟病菌进行了rDNA-ITS 分子鉴定，结果表明，病原菌为P.grisea，该结果与水稻稻瘟病的无性病原[11]一致。尽管狗尾草在田间一般作为农田杂草，但是由于该病原菌也可以为害包括水稻在内的作物而引起作物叶瘟病的发生，且该病原可以在病残体上越冬，所以该病害一旦发生，也同样需要控制，否则将会为来年初侵染积累充足菌源，造成作物叶瘟病的大面积流行。

表1 14 种杀菌剂对狗尾草叶瘟病菌的室内毒力Table 1 Laboratory virulence of 14 fungicides against P. oryzae

目前，关于狗尾草叶瘟病的化学防治尚未见报道，仅有草坪叶瘟病化学药剂田间防效的报道[15]，且关于狗尾草叶瘟病化学防治药剂筛选方面的研究亦尚未见报道。测定该病原菌对杀菌剂的敏感性，进而筛选出对其具有较高活性的杀菌剂，并将其应用于对狗尾草叶瘟病的防控已十分迫切。本研究通过室内分离得到了狗尾草叶瘟病菌株，并通过菌丝生长速率法测定了14 种杀菌剂对狗尾草叶瘟病的毒力，结果显示，狗尾草叶瘟病除对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵已产生较低水平的抗药性（EC50为3.219 6μg/mL） 外，对其他13 种杀菌剂均具有较高的敏感性，EC50为0.006 7～0.655 9 μg/mL。这13 种杀菌剂均可以作为化学防治狗尾草叶瘟病的候选药剂，但需要通过田间药效试验来进行验证，并进一步明确其施用方式和使用剂量。