海鞘附着相关微生物膜中细菌原核群落结构解析

刘倩倩 史宏伟 郭长禄 张治洲

（1.哈尔滨工业大学（威海）海洋科学与技术学院，威海 264209；2.山东省海洋船舶防污工程技术研究中心，威海 264209）

海鞘属于重要的海洋污损生物［1］。在全球范围内很多海域，海鞘可以占据污损生物总量的30%-70%。但是与藤壶、贻贝及管虫相比，针对海鞘的防污研究要少得多。通常情况下在清除船舰表面的藤壶和管虫时，不损伤船舰涂层几乎是不可能的；而海鞘可以很容易使用高压水枪清洗干净，且几乎对船舰表面涂层没有明显的损伤。这也是针对海鞘的防污技术研究较少的原因之一。可是海鞘在污损生物量中的占比经常非常大，给船舰航行增加的能耗不容小觑，且清除它们仍然要耗费大量的人力物力。所以海鞘的附着生长控制技术在防污领域内应该加大研究力度。

在众多不同的海洋防污技术研究领域，海洋微生物膜与污损生物幼虫附着过程之间的关系研究一直很受重视［2-4］。这里涉及几个重要的问题，一是不同的污损生物幼虫拥有不同的附着器官［5-7］，这些附着器官各自的附着机理需要很长时间才能研究清楚；二是海洋微生物种类繁多，在不同的附着表面形成具有不同组成结构和表面形貌的生物膜，且大部分海洋微生物目前都是不可培养的；生物膜内成百上千的细菌、真核微生物和其他微小生物存在着复杂的相互作用［8-9］。所以污损生物幼虫与海洋生物膜的相互作用机理也需要很多年才能逐一得到阐明。但是有一点理论上基本可以肯定，不同的污损生物幼虫会与海洋生物膜上特定的位置更容易产生互动。

海洋微生物膜与海鞘幼虫附着过程之间的关系研究已经积累了少量文献［10-15］，它们都是直接的实验观察结果。Wieczorek等［12］发现海水自然形成的生物膜对苔虫幼虫和海鞘幼虫的附着有截然不同的作用，1-12 d内形成的海水生物膜对苔虫附着有抑制作用，但对海鞘起促进作用，且越老的生物膜效果越好。张朝霞等［14］从几种海鞘的被囊表面及其附着基附近分离到9株细菌制备成细菌黏膜，发现不同细菌黏膜对冠瘤海鞘幼体的附着和变态所起的作用差别很大，甚至发现一种弧菌可以明显地促进附着却强烈抑制海鞘幼体变态。Zardus等［15］测试了不同天数形成的天然海水生物膜对次口海鞘、华美盘管虫、纹藤壶和总合草苔虫幼虫的附着强度；与光滑玻璃对照相比发现，生物膜的存在可以让海鞘幼虫的附着强度增加近一半。上述研究表明生物膜与海鞘幼虫的附着关系密切，但是具体与生物膜中哪些微生物关系密切需要更多的观察和研究。

本研究通过在两类不同的商用底漆中，分别添加4种防污性能不同的纳米材料，制备了8种不同的涂层。实海测试发现它们的综合防污打分比较接近［16］，但是在本研究中发现两类涂层上的海鞘附着程度差异十分明显。使用16S rRNA基因全长高通量测序分析两类涂层表面早期生物膜原核菌群的组成差异，试图初步从中找到与海鞘附着潜在密切相关的若干菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

使用3种碳纳米管（Carbon nanotubes，CNTs，TimesNano）和一种纳米铂（Sigma）（添加量均为0.1%，W/V，表1）与两种不同的常见商用底漆涂料制备复合涂层。底漆涂料选择环氧铁红防锈漆（铁红）和丙烯酸树脂成膜物（丙烯酸），均购自威海钦灏涂料有限公司。两种底漆涂料分别与碳纳米管充分混匀制备复合防污涂层，涂在钢板一面；室温固化72 h后涂制另外一面，在72 h后彻底风干固化后进行海洋实地挂板。实验所用钢板选择Q235材质的常见船体钢板，尺寸大小为500 mm×500 mm×3 mm，钢板上部左右边缘处各开一个直径15 mm的圆孔，用以固定粗尼龙绳。先利用抛光机打磨平整光亮，使用去离子水冲洗钢板表面，再用无水乙醇擦拭3次去除表面油污，自然风干后用铅笔划线均分为25块10 cm×10 cm小格（图1）。

表1 纳米材料信息

图1 涂层设计示意图

1.2 方法

1.2.1 涂层的表征 采用扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM，Zeiss MERLIN compact）对涂层进行表面形貌表征分析。以硅片为载体制作出对应纳米复合涂层，完全固化后做喷金处理并立刻进行表征。利用接触角测量仪（JGW-360B，承德市成惠试验机有限公司）测试上述涂层在室温条件下的静态接触角和表面润湿性能，在涂层表面随机取3个不同的位置测量并取平均值，测试液体使用的是纯水和0.22 μm过滤海水。

1.2.2 实地海洋浸没实验、生物膜样本采集、宏基因组提取 实海测试位置位于山东省威海市西港小石岛海域（N37°31'51″，E121°58'19″）的观景和科研观测两用平台。海水深度在10-12 m，挂板深度为2.5 m。观察取样时间为2019年夏季，挂板周期为28 d，分别在7 d、14 d、21 d、28 d对钢板各复合涂层表面生物膜取样，观察期间海鞘属于生物量最大的污损生物。每次取样时测量海水温度、pH值、盐度3种环境因子，5次取样的平均海水温度在18.7℃左右，pH值约为7.79，盐度为32±0.7%。钢板的A面涂覆铁红基质的涂层，包括铁红底漆分别添加4种纳米材料制备的复合涂层及铁红底漆阴性对照；B面涂覆丙烯酸基质的涂层，包括丙烯酸底漆分别添加4种纳米材料制备的复合涂层及丙烯酸底漆阴性对照；每种纳米材料从上至下设置4个重复，以消除浸没深度对菌群分布的影响。最下面一层涂覆阴性对照，不取样（图1）。图中“铁红”表示铁红阴性涂层，“丙”表示M133丙烯酸树脂成膜物阴性涂层。生物膜取样和后续处理参照文献［16-17］进行，每次共采集40个涂块的生物膜样本。采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（B518251，上海生工）获取生物膜宏基因组DNA。

1.2.3 16S rRNA基因全长高通量测序 将第28天提取的40个宏基因组样本按照每4个相同涂块等量混合成一个DNA样本的方式得到10个生物膜DNA。铁红涂层的海鞘（主要是玻璃海鞘）附着量明显多于丙烯酸涂层，后者在实验期间几乎未见明显的海鞘附着和生长，而其他污损生物在两类涂层上的附着程度差异远小于海鞘，第28天的观察结果见表2。所以本次挂板结果适合比较两类涂层上与海鞘附着可能密切相关的生物膜菌群结构差异。为此，将表2中的10个宏基因组样本作如下处理：铁红阴性对照记为S3，4个铁红纳米涂层宏基因组进一步等量混合成S4，丙烯酸阴性对照记为S7，4个丙烯酸纳米涂层宏基因组进一步等量混合成S8。

表2 第28天观察结果

1.2.4 qPCR验证Neptuniibacter菌含量课题组近期依据高通量测序结果为涂层中含量较高的Neptuniibacter属成功设计了一对特异性引物，上游引物：5'-CGC GTA GGT GGA TTG GSC-3'，下游引物：5'-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TTT AAC CTT-3'。利用实时荧光定量系统（ABI Stepone system）定量测定不同取样点、不同涂层表面生物膜样本中Neptuniibacter的相对含量，即测定样本中Neptuniibacter属16S rDNA总的拷贝数。通过获取更全面的各涂层定量信息，以达到进一步考察Neptuniibacter与海鞘的潜在作用规律的目的。qPCR定量测试的样本为4次取样的10个涂层总计40个生物膜宏基因组样本，使用标准PCR扩增产物连续稀释10倍获得10-1-10-5共5个浓度梯度作为定量标准制作标准曲线，用于制作标准曲线的标准样本及待测样本均重复3次［18］。PCR扩增体系为NPK62 2×buffer 6 μL，上下游引物各1.5 μL，Taq酶0.25 μL，基因组模板4.25 μL。扩增条件为94℃，4 min，（94℃，30 s；57℃，40 s；72℃，40 s）×42 个循环，72℃，2min。

2 结果

2.1 多样性指数分析（Alpha-diversity）

表3数据显示各组Coverage值均在0.96以上，可以较好地反映样本生物膜中微生物的真实情况。环氧铁红组的alpha多样性指数（Shannon和Simpson）低于丙烯酸树脂组；环氧铁红阴性组的多样性较添加CNTs组稍大，丙烯酸组与之相反。环氧铁红阴性组的observed_otus最高，添加CNTs后OTU数明显减少，但在丙烯酸树脂组添加CNTs前后差异却非常小，暗示了纳米材料对铁红涂层性质影响较大，而对丙烯酸涂层影响较小。

表3 原核菌落多样性参数

2.2 物种分类与丰度分析

16S测序结果表明，全部样品中包含的OTU个数为778，涵盖了26个门，40个纲，80个目，144个科，284个属，350个种的菌类。图2为4组生物膜样本细菌在属层面上的相对丰度比较，排名前9位的均隶属于Proteobacteria（变形菌门）。其中，Cycloclasticus（解环菌属）丰度最高，在两种底漆基质丰度占约为19%-22%。其次是Rhodovulum（小红卵菌属），该属在环氧铁红底漆中丰度（16.6%-17%）远高于丙烯酸底漆（2%-3%），含有CNTs的生物膜组丰度略高于阴性对照组。Neptuniibacter属隶属于Oceanospirillaceae（海洋螺杆菌科）在环氧铁红底漆中相对丰度达到11.6%左右，然而在丙烯酸底漆中该菌属含量几乎为零；而海洋螺杆菌科的另一属Neptunomonas的丰度状况与Neptuniibacter恰好相反，在环氧铁红底漆中丰度极低，仅占1%左右。Sulfitobacter（亚硫酸杆菌）的丰度低于前几种菌，丙烯酸底漆中丰度（6.3%）略高于铁红底漆（1.1%）。

图2 属分类水平的丰度比较

图3为4组生物膜样本细菌在种层面的丰度比较，除了占20%左右的未知菌种外，丰度排名最前的两名依然是Cycloclasticus pugeti和Rhodovulum sp.KU27F。Cycloclasticus pugeti在各组生物膜中差异量不大；Rhodovulum sp.KU27F3在铁红底漆中丰度很高（约为18%），在丙烯酸底漆中丰度很小（仅为2%-3%），为铁红组的1/7左右。Neptuniibacter sp._CAR-SF在丙烯酸组中的丰度近乎为零（0-0.03%），而铁红组丰度在3%-5%之间，形成了极大的差异。Cellvibrionales unclassified菌也有类似情况，在铁红涂层（占比3%-5%）中含量远高于丙烯酸涂层（0%）。Neptuniibacter_sp._CAR-SF和Cellvibrionales unclassified菌的含量在铁红涂层中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂层中几乎为零，对应的OTU序列读数在两类涂层中相差100倍以上。由于该两种菌在两种基质中含量构成的明显差异，后续便使用qPCR定量实验方法进一步验证这一差异。

图3 种分类水平的丰度比较

图4-A为qPCR样本的扩增产物融解曲线，各样本的扩增产物呈现单一的融解峰，说明扩增产物特异性较好，定量结果可信。由图4-B可以看出，丙烯酸涂层中Neptuniibacter属的含量比铁红涂层要低几倍到几十倍，这与高通量测序的结果一致。另外，qPCR数据显示，Neptuniibacter在铁红涂层较之于丙烯酸涂层中的含量优势从第7-14-21-28天是逐渐增大的，但是铁红/DPt涂层的上述优势一开始就很大，而该涂层表面海鞘的平均附着程度也是所有涂层中最大的（表2）。暗示Neptuniibacter属的存在对海鞘的附着可能是因而不是果。

图4 qPCR溶解曲线（A）涂层生物膜样本中Neptuniibacter属的qPCR测定结果（B）

2.3 PCA分析

PCA（Principal component analysis）分析即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，可以用来对含有多参数变量的一组复杂样本进行聚类分析。如图5所示，S3与S4之间的差距大于S7与S8之间的差距，说明丙烯酸涂层添加纳米材料前后的菌群结构变化相对较小，而铁红基质在添加纳米材料前后其菌群结构发生很大的变化。另外，图5横坐标反映了92.7%的差异，而纵坐标只反映了6.09%的差异，说明两种基质带来的菌群结构差异远大于纳米材料在两种基质中带来的菌群结构差异。

2.4 表征结果

图6为放大1 000倍后，两种阴性涂层及其对应的共8种纳米涂层的SEM图片。可明显观察到两种底漆的表面形貌有很大的差别，本研究所用的环氧铁红基质的5个涂层（a-e）均比较粗糙，丙烯酸基质的5个涂层（f-j）除表面除少量突起外，观察窗口下表面较为光滑平整。铁红涂层表面与自身对照相比并没有观察到纳米材料在表面形成任何规律性的形貌，说明尽管大部分纳米材料被埋藏于表面以下，但是仍然对涂层表面性质产生了一定的影响，继而改变了生物膜中菌群的多样性特征；丙烯酸涂层与自身对照相比表面出现了较大的颗粒，可能暗示这些纳米材料在基质中的聚集现象。

图5 复杂菌群组成差异的PCA分析

表4为10个涂层的静态接触角测试结果。每种基质在添加纳米材料前后表面接触角数值非常接近。无论浸润液体为纯水还是海水中，两种涂层均表现出亲水性（接触角＜90°），在海水环境中，丙烯酸基质涂层疏水性略大于铁红基质涂层，两种涂层的浸润性能差别不大。

3 讨论

本研究以铁红防锈漆和丙烯酸树脂成膜物为基质，混合4种CNTs制备了两类涂层。经过实地海洋挂板，发现两类涂层上海鞘的附着程度有很大差异。采集了涂层表面生物膜并提取宏基因组DNA进行16S rRNA全长高通量测序，分析了原核微生物在两类不同基质中的菌落组成、多样性分析及物种丰度，以及添加纳米材料对涂层表面菌群结构的影响。

全长测序表明涂层表面的原核菌群以变形菌门为主，在两种基质占比达80%以上，这与非全长测序结果一致［19］。属层面丰度最高的Cycloclasticus菌是一种嗜油类微生物，在我国海域分布较广。Rhodovulum、Neptuniibacter两种菌在不同基质中形成了十分明显的差异，铁红基质有大量的分布，而丙烯酸基质分布极少，尤其是Neptuniibacter菌丰度近乎为零。文献表明前一种菌的部分菌株能适应较宽的CO2浓度范围，在海岸线、内陆环境中高效同化CO2，对缓解全球变暖具有重要意义［20］。Neptunomonas与Neptuniibacter同属一科，丰度分布规律则恰恰相反，同一种常见的海水养殖中后期优势菌（Sulfitobacter）［21］在丙烯酸涂层中大量分布，而在铁红基质中仅占比1%左右。全长测序能在种层面提供较为全面的信息，本研究初步发现的两个菌株Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified与海鞘存在积极的作用关系，但目前还没有任何与海鞘幼虫附着相关的生物学报道。其中海洋细菌Neptuniibacter sp.CAR-SF被发现可以降解咔唑［22-23］，而Cellvibrionales unclassified尚未完成基本的命名，需要在后续的研究中进一步确认并加强功能研究。

图6 涂层的SEM表征结果

关于纳米材料对生物膜菌群组成的影响，所观察到的结果比较出人意料。在两类基质的涂层中，几种纳米材料对生物膜菌群的组成影响较小。通过SEM表征发现100 μm的观察窗口下铁红涂层表面比较粗糙，且表面局部形貌的形状不规则，而丙烯酸树脂成膜物涂层表面相对光滑，有少量细小颗粒状突起。本研究所用的纳米材料除纳米铂以外长度都在10 μm以上，添加纳米材料之后表面的无规则凸起数量也有增多，但在2-10 μm的观察窗口下并不明显，纳米材料对表面结构未产生大的影响。肉眼对涂层进行观察时发现添加了CNTs的涂层颜色偏暗，丙烯酸的透明基质中能发现分布较为均匀的黑色小颗粒，或为部分CNTs聚集所致，这一现象可以更有力的说明纳米材料不是浮于表面而发挥防污作用，而是悬浮或沉积于底部，但仍然在一定程度上改变了涂层的表面性质［16，24-25］。这一点需要后续研究中设法消除纳米材料的聚集并实施更细致的形貌分析（如原子力显微镜）和理化参数分析。

表4 全部涂层的静态接触角

基于丙烯酸酯及其衍生物作为基质的涂层具有优越的防污性能［26］，若想研制出具备更高环保性质的防污涂层则离不开对污损生物幼虫附着机制的研究，且这类机制的研究与涂层表面生物膜关系是密不可分的。

4 结论

本研究发现丙烯酸基质的原核菌群多样性略高于铁红基质，纳米材料的添加对两类涂层上菌群结构的改变程度都比较有限，但是两类涂层中个别菌种的含量差异非常巨大。差异最大的两个种分别是Neptuniibacter sp.CAR-SF和Cellvibrionales unclassified，两者在铁红涂层中含量均在4%左右，而在丙烯酸涂层中几乎为零，对应的OTU序列读数在两类涂层中相差100倍以上，构成的差异十分明显。而qPCR结果进一步证实了Neptuniibacter属在两类涂层中含量相差确实很大，暗示了该菌的存在对玻璃海鞘的附着可能具有诱导作用。目前尚未发现关于该两种菌与海鞘附着相互作用关系的文献，上述研究结果的进一步确认需要将来更细致的探索。