四烯甲萘醌保护成骨细胞氧化损伤的作用研究

蒋益忠，林丽娟，辛海量，金玉娥，蒋益萍，薛黎明 （. 浙江省东阳市中医院，浙江 东阳 05；. 海军军医大学药学院生药学教研室，上海 004；. 上海市疾病预防控制中心化学品毒性检定所，上海 006）

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是以骨微细结构破坏和骨量减少为特征的全身性骨代谢疾病，可导致骨脆性和骨折风险增加，多见于老年人。衰老是致骨质疏松的一个重要因素，随着机体的衰老，骨骼中过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨细胞的增殖、分化和成熟，抑制成骨细胞分泌骨基质及骨基质的矿化，同时促进破骨细胞骨吸收，导致骨质疏松的发生。2018 年国家卫生健康委员会发布OP 流行病学调查结果显示，我国65岁以上人群OP 患病率达32.0%，其中，男性为10.7%，女性为51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在临床上常单独或协同用于防治老年性骨质疏松症，疗效显著[2-3]，是我国现版《原发性骨质疏松症诊疗指南》和《骨质疏松症中西医结合诊疗指南》的推荐药物[1-2]。药理研究发现，MK4能促进成骨增殖、分化和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通过调节氧化应激相关基因和蛋白，在成骨细胞骨形成中发挥保护作用[5]，且能阻止成骨细胞凋亡[6]。过氧化氢(H2O2)是ROS 在体内存在的主要形式，会穿透成骨细胞造成细胞损伤，本研究拟探讨MK4对H2O2刺激成骨细胞氧化损伤的保护作用和调控机制，阐明MK4抗老年性骨质疏松的作用机制。

1 材料

成骨细胞系MC3T3-El（中国科学院上海生命科学研究细胞资源中心）；特级胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、双抗(青霉素和链霉素混合液)和PBS 缓冲液(pH=7.2)均购自美国GIBCO 公司；噻唑蓝（MTT）、MK4（Sigma 公司）。过氧化氢 (H2O2，比利时 Acros Organics 公司）；丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、JC-1 线粒体膜电势(MMP)试剂盒和活性氧(ROS)试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、核酸提取试剂盒、反转录试剂盒和扩增试剂盒（均为Thermo Fisher 公司产品）；叉头框蛋白 (FoxO1 和FoxO3)、β 细胞淋巴瘤/白血病基因 2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2 方法

2.1 MTT 法检测成骨细胞活力

复苏MC3T3-El 小鼠成骨细胞系，置于5 ml含 10% FBS 的 DMEM 培养基中，放入 37 ℃、5%CO2培养箱。以2×104/ml 浓度的成骨细胞接种于96 孔培养板中培养 24 h 后，分别采用 0、10、20、50 和 100 μmol/L(n =10)的 H2O2处理，培养 4、12、24 h 后，采用碧云天MTT 试剂盒测定细胞活力。

以2×104/ml 浓度的成骨细胞接种于96 孔培养板中培养24 h 后，并按空白、氧化应激模型、药物剂量分组：①对照组，②选择合适浓度H2O2组，③H2O2+10 μmol/L MK4组，④H2O2+1 μmol/L MK4组，⑤H2O2+ 0.1 μmol/L MK4组。加入药物培养24 h，采用MTT 法检测细胞增殖活性。

2.2 成骨细胞 ALP 活性

以2×104/ml 浓度的成骨细胞接种于96 孔培养板中培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，连续培养6 d，每3 d 换液1 次，采用硝基苯酚磷酸二钠法检测ALP 活性。给药6 d 后，弃培养液，PBS 洗 3 次，依次加入 100 μl 二乙醇胺（50 mmol/L），50 μl 的对硝基苯酚磷酸二钠（2.5 mmol/L），在 37 ℃孵育 30 min，再加入 50 μl 的 0.3 mol/L 氢氧化钠溶液终止反应，置405nm 处，测吸光度值(A)。以不同浓度的对硝基苯酚溶液绘制标准曲线，ALP 活性由每孔释放的对硝基苯酚的μmol 数表示。

2.3 成骨细胞骨结节面积

以5×104/ml 浓度的成骨细胞将MC3T3-El 细胞接种于 12 孔板内，放入 37 ℃，5% CO2培养箱，12 h 后换骨结节诱导培养基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml 抗坏血酸以及10%胎牛血清的DMEM 培养基)培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，每3 d 换液1 次，连续培养14 d，采用0.1%茜素红-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色，37 ℃下染色30 min，采用倒置相差显微镜 (Leica DMI 3000)观察，并随机拍照10 张，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨结节面积。

2.4 细胞线粒体膜电势、ROS 和氧化应激酶MDA、GSH、SOD 测定

以 2×105/ml 细胞浓度铺 6 孔板，培养 24 h 后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h 后，用荧光酶标仪法分别测定JC-1 单体和复合物的荧光，DCFH-DA 探针法测活性氧水平，ELISA 法测定 GSH、SOD 和 MDA 水平。

2.5 细胞凋亡检测

以 1×106/ml 细胞浓度铺 6 孔板，培养 12 h 后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h 后，依据Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书，采用流式细胞仪法检测。

2.6 RT-PCR

以 1×106/ml 细胞浓度铺 6 孔板，培养 12 h 后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h 后，依据试剂盒说明书进行提取总RNA 和反转录后，分别 对GAPDH 、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2 和bax 进行 RT-PCR 扩增，引物序列见表 1，PCR 反应条件：采用预变性 95 ℃、10 min，变性 95 ℃、45 s，退火 60 ℃、45 s，延伸 72 ℃、50 s，循环 40 次，总反应体系为 10 μl。

2.7 统计学分析

每组实验重复3 次。采用SPSS 软件经ANOVA方差分析检验，差异有统计学意义（α=0.05），再采用Student's t test 检验进行两组比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 小鼠引物序列

3 结果

3.1 H2O2 处理 MC3T3-El 成骨细胞

MC3T3-E1 经 0～100 μmol/L H2O2分别处理4、12、24 h，结果发现 0～100 μmol/L H2O2处理4 h 对细胞活力均无显著性影响(P＞0.05)，处理12 h 后，在 50 和 100 μmol/L H2O2下的细胞活力显著降低，分别降低19.4%和33.4%。H2O2干预24 h后，在 20、50、100 μmol/L 均具有显著性差异，分别降低13.2%，47.4%和57.9%(表2)。故后续实验选择 20 μmol/L处理 24 h。

3.2 MK4 对H2O2 损伤成骨细胞增殖、ALP 活性和骨结节形成的影响

MC3T3-E1 经 20 μmol/L H2O2处理 24 h 后，结果显示，显著抑制了成骨细胞的细胞活力(P＜0.05)，ALP 活性 (P＜0.05) 和骨结节形成面积 (P＜0.05)，与空白组比较，分别降低13%、16%和85%，见表 3 和图 1。与模型组比较，MK4在 1～10 μmol/L可促进H2O2损伤成骨细胞增殖(P＜0.05)。同样，MK4在 1～10 μmol/L 能显著改善 ALP 活性 (P＜0.05)和提高骨结节形成面积(P＜0.05)，分别增加50.7%和 44.5% (表 3 和图 1)。

3.3 MK4 对H2O2 损伤成骨细胞线粒体膜电势、活性氧和抗氧化酶的影响

MC3T3-E1 成骨细胞 经 20 μmol/L H2O2处理24 h 后，结果发现显著降低成骨细胞膜电势和增高活性氧含量 (P＜0.05)。与模型组比较，MK4在10 μmol/L 可促进H2O2损伤成骨细胞膜电势升高和降低活性氧含量(P＜0.05)。与空白组比较，20 μmol/L H2O2能显著降低 FoxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA 表达 (P＜0.05)。与 H2O2组比较，给予10 μmol/L MK4后，FoxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA表达均显著增高(P＜0.01)。

3.4 MK4 对H2O2 损伤成骨细胞凋亡的影响

在通道1 和通道2 观察单个细胞分布区域，选定99.9%的细胞区域用于后续分析，在通道3 和通道4 观察凋亡细胞分布，Q4 为正常细胞，Q1 为坏死细胞；Q2 为晚期凋亡细胞，Q3 为早期凋亡细胞。与对照组比较，20 μmol/L H2O2处理 24 h 后，细胞的凋亡率显著增高(P＜0.05)。经0.1～10 μmol/L 浓度 MK4干预 24 h 后发现，1～10 μmol/L浓度MK4能显著降低细胞凋亡率(P＜0.05)，与对照组相近，见表3 和图2。与空白组比较，20 μmol/L H2O2能显著降低 Bcl-2 的 mRNA 表达 (P＜0.001)，bax 表达无显著差异，给予 10 μmol/L MK4后，Bcl-2和bax 的mRNA 表达均显著增高(P＜0.01)，见图3。H2O2组的bax/Bcl-2 比值为对照组的22.5 倍，而MK4处理后降低至对照组的7.6 倍。

表2 H2O2 处理的时间与浓度对成骨细胞活力的影响

表3 MK4 对 H2O2 损伤成骨细胞的影响

图1 MK4 对 H2O2 损伤成骨细胞骨结节的影响 (×200)

图2 MK4 对 H2O2 损伤成骨细胞凋亡的影响

图3 MK4 对 H2O2 损伤成骨细胞氧化和凋亡相关mRNA 表达的影响

4 结论与讨论

骨代谢中，机体通过调节FoxOs 转录因子的活性，产生抗氧化物酶，对抗氧化应激对骨骼的损伤，包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6 等，其中，FoxO1 和FoxO3 是调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要分子[7]。活性氧可激活FoxO1 的转录，调节线粒体抗氧化酶Mn-SOD 的活性[8]。随着活性氧的升高，FoxO3 下调，成骨细胞分化受损，抑制骨形成作用[9]。本研究发现，MK4对H2O2引起的氧化应激具有显著的改善作用，降低活性氧和脂质氧化产物MDA 水平，上调转录因子FoxO1、FoxO3 和抗氧化酶SOD 的mRNA 表达。

Bcl-2 蛋白可减少氧化应激水平，而bax 基因可与Bcl-2 形成异源二聚体，抑制Bcl-2 的作用，进而诱导细胞凋亡。MK4可上调Bcl-2/bax 比值，抑制了成骨细胞凋亡[10]。本研究发现，H2O2能显著提高成骨细胞凋亡率，同时增加bax 的表达，降低Bcl-2 蛋白表达。MK4处理组对成骨细胞凋亡的拮抗作用明显，随着剂量浓度增加而增加。MK4在在氧化应激状态下，可显著上调Bcl-2，下调bax 的基因表达，bax/Bcl-2 比值显著降低，抑制了成骨细胞凋亡。

FoxOs 激活促进Bcl-2 相关凋亡调节蛋白(Bim)转录，Bim 是线粒体凋亡通路的核心调控者，引起成骨细胞线粒体膜电位降低[10]。线粒体跨膜电位降低说明线粒体膜通透性转运孔(MPTP) 过度开放。若MPTP 过度开放，易引起呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压增高，使得促凋亡活性物质从线粒体释放入细胞基质，导致细胞凋亡。MK4显著改善了H2O2刺激的成骨细胞线粒体膜电势降低，表明MK4对H2O2刺激成骨细胞的氧化损伤具有保护作用。

综上所述，MK4能显著抑制H2O2刺激的成骨细胞氧化损伤，机制与FoxO 转录因子相关。同时，MK4对H2O2引起的成骨细胞凋亡具有拮抗作用，其机制为上调Bcl-2 和下调bax 的基因表达。