宏基因组来源的酯酶酶学性质及对邻苯二甲酸酯的降解*

刘艳艳，刘孝龙，赵萌，范新炯，3

（1. 安徽医科大学基础医学院，安徽合肥230032；2. 中国科学技术大学化学与材料科学学院，安徽合肥230026；3. 中山大学生命科学学院，广东广州510275）

邻苯二甲酸酯（phthalates esters，PAEs）是塑料工业生产中的一种增塑剂和软化剂，用来提高塑料的弹性和柔韧性，因此被广泛应用于工业塑料产品和消费品中，如农药、润滑剂、橡胶、建筑材料、医疗器材、化妆品、餐具、儿童玩具等，其在塑料制品中的添加量高达20%～50%［1-2］。全球每年PAEs的使用量约1.8 亿t，而且这一数据可能会持续增长［3-5］。在塑料中，PAEs与塑料基质以非共价的形式结合，因此在塑料产品的生产、使用和废弃处理过程中，PAEs 很容易从塑料产品中释放出来进入环境［6］。PAEs 在我国水资源和土壤环境中检出率较高，长江、黄河和松花江等河流的多处水域受到PAEs 的污染，其浓度超出国家规定的饮用水标准限值［7］。大量研究表明，PAEs 的残留直接影响动植物的生长，同时在动植物体内蓄积，通过食物链转移到人体，危害人类的健康［5］。PAEs 作为一种环境内分泌干扰物，还可以通过消化、呼吸系统和皮肤等多种途径进入人体，在人体内蓄积，并对人体造成伤害［8］。多项研究表明，长期接触PAEs 可诱导胎儿死亡、癌症发生、肝脏功能和肾脏功能损伤［9］。也能够导致雄性生殖毒性，主要体现为促黄体生成素（LH）、睾酮、卵泡刺激素（FSH）等激素水平的改变，精子质量降低，严重的会导致睾丸癌［10-11］。产前接触PAEs 会影响母体甲状腺激素和性激素的分泌，同时其可能导致妊娠期高血压子痫及妊娠期糖尿病等疾病的发生、发展［12-15］。所以，有必要寻找消除PAEs污染物的有效途径。

生物降解是去除环境中PAEs 的主要途径，具有高效、低成本和环境安全等特点［16］。生物降解途径是通过酯酶逐步脱酯化反应，先生成相应的邻苯二甲酸单酯，然后生成邻苯二甲酸［17］。近些年通过基因组文库法、基因组或转录组测序及注释分析等方法克隆出了水解PAEs 的酯酶，但是数量并不多。来源于芽孢杆菌HJ14的酯酶EstZ1对邻苯二甲酸二乙酯（DEP）有降解作用［18］；Sulfobacillus acidophilus DSM10332 中的PAEs 酯酶EstS1、来源于废水生物膜的宏基因组文库的酯酶DphB 以及克隆于Camelimonas sp. M11 的酯酶均不能水解毒性更大的邻苯二甲酸二甲酯（DMP）［19-21］；来源于Picrophilus torridus 的PAEs 酯酶EstPt1 和Acinetobacter sp. LMB-5 的酯酶Est_3563 对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）有降解作用［22-23］；从土壤宏基因组文库中克隆FAEs 酶BDS4 能水解DMP、DEP、DBP，对邻苯二甲酸二丙酯（DPrP）以及其它中长侧链的PAEs 无降解作用［24］；从Bacillus velezensis SYBC H47 中克隆的酯酶BaCEs04 能够水解DMP、DEP、DPrP、DBP，但是不能降解邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二己酯（DnHP）［25］。上述酯酶能够水解邻苯二甲酸二烷基酯生成相应的单酯，但大多数酶对PAEs的降解谱较窄。来源于Acinetobacter sp. M673 的酯酶能够水解DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP 等多种PAEs 为相应的单酯，底物谱较广，最适pH 为7.5，但在碱性pH 中耐受性较差［26］。现阶段所筛选到的酯酶最适pH 多在7.5 ～8.0范围内，虽然酯酶EstZ1和酯酶EstPt1 最适pH 超过8.0，但是只能降解一种PAEs［18，23］。因此，筛选具有广谱PAEs 降解活性和良好环境适应性的酯酶具有重要意义。

本研究构建土壤宏基因组文库，利用功能筛选方法，从中克隆新的酯酶基因，并对其进行异源表达，研究其酶学性质，以期获得广谱PAEs 降解活性和良好环境适应性的新酯酶，为有效修复PAEs污染环境奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 化学品和材料 对硝基苯酚酯均购自Sigma 公司（美国）；T4DNA 连接酶、限制性核酸内切酶、DNA 聚合酶和低相对分子质量蛋白质标品购自TaKaRa（中国，大连）并根据制造商的推荐使用；E. Z. N. A®Plasmid Mini Kit 和E. Z. N. A®Gel Extraction Kit 购自OMEGA（美国）；三丁酸甘油 酯、罗 丹 明B、PAEs （DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP）、氨苄青霉素钠（AMP）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kana）和5-溴- 4-氯- 3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）购自Aladdin（中国，上海）；蛋白纯化试剂盒（His·Bind®Purification Kit）购于Novagen 公司（德国）；胰蛋白胨、酵母提取物购于OXOID 公司（英国）；引物合成和基因测序由华大基因完成；除另有说明外，其它化学品和试剂均为分析级，并从商业来源购买。

1.1.2 培养基的制备

1）LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，调pH 至7.0 并定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

2）LB 固体培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，加入w 为1.5%～2%的琼脂粉，调pH 至7.0，定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

3）酯酶筛选培养基：LB 固体培养基中加入100 μg/mL AMP（或100 μg/mL Kana）、0.1 mmol/L IPTG、0.1%（V/V）三丁酸甘油酯和0.1 mg/mL罗丹明B。

1.1.3 细菌菌株和质粒 使用Escherichia coli DH5α 和E. coli BL21（DE3）（本实验室保存）作为 分 子 克 隆 的 宿 主。 pUC118 （TaKaRa） 和pET-41a（+）（Novagen）分别用于构建宏基因组文库和基因表达。

1.1.4 实验仪器 Multiskan Go 全波长酶标仪（Thermo）、PCR 扩增仪（Bio-Rad）、恒温摇床（上海智诚生物有限公司）、隔水式电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、移液器（Eppendorf）、蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、核酸电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、超声破碎仪（Sonics）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（合肥华泰集团股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 宏基因组文库的构建和筛选 按参考文献［27］的方法提取DNA，将提取的总DNA 用BamHⅠ不完全酶切，回收3～8 kb 大小的片段并连接到pUC118 载体中，然后将连接产物转入到宿主E.coli DH5α，将转化产物涂布到酯酶筛选培养基（含终质量浓度为100 μg/mL 的AMP）上，37 ℃培养过夜。含有酯酶基因的阳性克隆菌能够水解培养基中的三丁酸甘油酯，在菌落周围形成透明圈，罗丹明B可使透明圈清晰可见。因此，挑出具有明显透明圈的单克隆，进一步测试其对对硝基苯酚乙酸酯（p-NPC2）的水解能力，确定有活性的阳性克隆进行测序。利用NCBI 提供的ORF Finder 进行开放阅读框（open reading frame， ORF）搜索，利用NCBI 提供的BLAST 程序进行数据库同源搜索。用ClustalX 软件分析了氨基酸序列相关酶的保守基序。

1.2.2 酯酶基因的克隆、表达和纯化 通过PCR

从pUC118 重组质粒中扩增目的基因est924。在PCR 引物中引入BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点，引物序列为：Forward：5′- TTATTGGATCCATGCCCAGCCAACAGCTCGC-3′（下划线部分为BamHⅠ酶切位点）；Reverse：5′-ATCCAAGCTTCTAGCCGTGCTTGCGCACGAA- 3′（下划线部分为HindⅢ酶切位点）。 PCR 程序为：98 ℃，3 min；98 ℃，30 s ，63 ℃， 30 s，72 ℃，30 s，30 个循环；72 ℃，10 min。

将扩增产物以w=1%的琼脂糖凝胶电泳，利用E. Z. N. A®Gel Extraction Kit 回收目的片段。纯化后的目的片段经BamHⅠ和HindⅢ酶切后与经同种酶处理的pET-41a（+） 载体连接，并转入E. coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布于酯酶筛选培养基（100 μg/mL Kana），37 ℃培养过夜。阳性克隆接种于LB液体培养基（含100 μg/mL Kana）中，37 ℃、190 r/min 条件下，恒温过夜培养。再以1/100 的接种量将活化的菌液转接到LB 液体培养基（含100 μg/mL Kana）中，37 ℃、200 r/min振荡培养2～3 h，当A600在0.5～0.6 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 于30 ℃诱导表达8 h。收集菌体超声波破碎，12 000 r/min 离心5 min 获得粗酶液。用Ni-NTA 纯化目的蛋白，加入φ=50%甘油，-20 ℃保存备用。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定变性蛋白的相对分子质量，并用考马斯亮蓝染色以确定其相对分子质量的大小［28］。利用BCA蛋白定量测定纯化蛋白浓度。

1.2.3 底物特异性 依据Fan 等［27］研究方法，使用酯酶/脂肪酶的通用底物p-NPC2、对硝基苯酚丁酸酯（p-NPC4）、对硝基苯酚己酸酯（p-NPC6）、对硝基苯酚辛酸酯（p-NPC8）、对硝基苯酚葵酸酯（p-NPC10）、对硝基苯酚月桂酸酯（p-NPC12）、对硝基苯酚棕榈酯（p-NPC16）等研究Est924的底物特异性。以pH 7.0、100 mmol/L 的磷酸钾缓冲液配制100 mmol/L的底物工作液，用于检测Est924对不同碳链长度的底物的水解特性。底物与酶在55 ℃反应5 min 后，反应液在405 nm 波长下测定A值。最高酶活性计为100%，以相对酶活性对底物作图，以确定底物特异性。

1.2.4 最适温度 将适量的重组酯酶Est924 与100 mmol/L 的p-NPC4 为底物混合，分别置于20、30、40、50、55、60 和65 ℃的温度下孵育5 min后，在405 nm 波长下测定A 值，以确定最适温度。最高酶活性计为100%，以相对酶活性对温度作图。

1.2.5 最适pH 首先配制不同pH 的缓冲液，然后配制不同pH 的p-NPC4 工作液（pH 6.47～9.18）。将适量的重组酯酶Est924 与不同pH 的底物工作液在55 ℃下反应5 min 后，在405 nm 波长下测定A 值，以确定最适pH。最高酶活性计为100%，以相对酶活性对pH作图。

1.2.6 温度稳定性 将适量的酯酶在25、30、40、45、50 ℃等水浴中孵育，不同时间取样。以p-NPC4 为底物，55 ℃下反应5 min 后，反应液在405 nm波长下测定A值，测定其剩余酶活性。以未经热处理的初始酶活定义为100%，以相对酶活性对温度作图，以评估酶的热稳定性。

1.2.7 pH稳定性 通过浓缩菌体进行超声波破碎以减少缓冲液本身对pH 的影响。适量的重组酯酶Est924 在 不 同pH 的Na2HPO4-KH2PO4缓 冲 液 中，30 ℃水浴孵育，不同时间进行取样。以p-NPC4 为底物，55 ℃下反应5 min后，反应液在405 nm波长下测定A值，测定其剩余酶活性。以未经处理的酶活性定义为100%，以相对酶活性对pH作图，以确定其pH稳定性。

1.2.8 生化试剂对重组酯酶Est924 的影响 在酶液中加入终浓度为1 mmol/L金属离子（MgCl2、CaCl2、KCl、MnCl2、CoCl2、AlCl3、CrCl2、FeCl3、EDTA）和终浓度为1% （V/V）的有机溶剂（Tween-80、Triton X-100）。0 ℃放置24 h 后，以p-NPC4 为底物，55 ℃下反应5 min，反应液在405 nm 波长下测定A值，测定其剩余酶活性。以未经生化试剂处理的酶活性定义为100%。评估金属离子和有机溶剂对酶活性的影响。

1.2.9 重组酯酶Est924 对邻苯二甲酸酯的降解能力 根据Huang 等［29］方法，检测重组酯酶Est924对邻苯二甲酸酯的降解能力。反应体系1 mL，包括：1.6 μL 的PAEs （DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP）溶解于50 μL 二甲基亚砜（DMSO）、100 μL 粗 酶 液、848.4 μL pH 7.0 （10 mmol/L）Tris-HCl 缓冲液。以不加酶液为对照，在45 ℃反应3 h 后，用等体积的乙酸乙酯进行萃取。取适量萃取液点于硅胶板上，进行薄层层析（TLC）检测。展层剂为：石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸（体积比为20∶1∶0.5）。展层结束后取出硅胶板，并在235 nm紫外灯下观察。

2 结 果

2.1 宏基因组文库的构建和筛选

从约12 000 个克隆子的土壤宏基因组文库中，筛选获得了一个在酯酶筛选培养基上产生水解透明圈的阳性菌。对测序结果分析，发现一个924 bp大小的酯酶基因，并命名为est924，序列见附加材料1。该基因编码由307个氨基酸残基构成的蛋白，此蛋白与已报道的来源于Synechococcus sp. CC9311的alpha/beta-水解酶具有最高同源性（62.42%），与来源于未培养微生物的酯酶（QCQ29100.1）具有49.51%的同源性。将Est924 与已报道的PAEs水解酶多序列比对分析，结果如图1所示，发现编码的蛋白中存在典型的催化三元组：位于保守基序G-X-S-X-G 中心的活性位点丝氨酸（S152）、保守的天冬氨酸（D253）和组氨酸（H279）。

2.2 酯酶基因的克隆、表达和纯化

以p-UC118 重组质粒为模板，经PCR 扩增得到一个大小924 bp 的基因片段，大小与预期一致。以pET-41a（+）为载体、E. coli BL21（DE3）为宿主菌构建重组菌。重组菌诱导表达后的蛋白利用Ni-NTA 分离纯化，SDS-PAGE 电泳检测纯化后蛋白，如图2所示，箭头指示目的蛋白，已去除绝大多数的杂蛋白。目的蛋白的相对分子质量为58 320，其中包含24 550的融合标签，与预测的蛋白相对分子质量相符。

2.3 重组酯酶Est924的酶学性质表征

2.3.1 底物特异性 选用酯酶/脂肪酶的通用底物研究Est924 的底物特异性，结果见图3。在所检测的对硝基苯酚酯中，重组酯酶Est924 对p-NPC4 的活性最高，p-NPC2、p-NPC6、p-NPC8 活性分别为p-NPC4 的50%、20%、14%，对p-NPC10、p-NPC12、p-NPC16几乎没有活性。说明酯酶的最适底物为p-NPC4，更适合降解短链至中链的对硝基苯酚酯。以p-NPC4 为底物时，该酶的Km和Vmax分别为77 μmol·L-1和6 μmol·L-1·min-1。

图1 Est924的多序列比对分析Fig.1 Multiple sequence alignment of Est924

图2 重组蛋白Est924的SDS-PAGE鉴定Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of esterase protein

箭头所指出重组蛋白Est924；M:低相对分子质量标准蛋白(TaKaRa);1:纯化前的重组蛋白Est924; 2:纯化后的重组蛋白Est924

图3 重组蛋白Est924的底物特异性Fig.3 Substrate specificity of Est924

2.3.2 最适温度 在20、30、40、50、55、60、65 ℃下测定温度对酯酶Est924 活性的影响，结果见图4。随着温度的升高，酯酶活性逐渐升高，当温度超过55 ℃时，酯酶活性下降，说明其最适温度为55 ℃。在30～60 ℃温度范围内，相对酶活性均在60%以上，说明该酶具有很好的温度适应性。

2.3.3 最适反应pH 在pH 6.47 ～9.18 的范围内，以p-NPC4 为底物，测定酯酶的最适反应pH，结果见图5。重组酯酶Est924 在pH 8.34 时活性最高，在pH 7.38～9.18 的范围内，相对酶活在80%以上，表明该酶在中性至碱性条件下有很好的适应性。

2.3.4 温度稳定性 将酯酶Est924 在25、30、40、45、50 ℃分别保温不同的时间，以评估其热稳定性，结果见图6。重组酯酶Est924 在25 ℃和30 ℃处理24 h 后，保留80%以上的活性，说明酯酶在30 ℃以下十分稳定；在40 ℃孵育12 h 后仍保留约50%的酶活性。以上表明该酶在中低温条件下具有较好的热稳定性。但50 ℃时酶活性下降较明显，热处理2 h的剩余酶活性为20%。

图4 温度对重组酯酶Est924活性的影响Fig.4 Effect of temperature on activity of Est924

图5 pH对重组酯酶Est924活性的影响Fig.5 Effect of pH on activity of Est924

2.3.5 pH 稳定性 重组酯酶Est924 在不同pH（6.47～9.18）缓冲液中处理不同的时间后检测剩余酶活性，以此确定pH 对酯酶稳定性的影响，结果见图7。pH 6.47 时，孵育5 h 酯酶活性下降到50%左右；pH 6.98 时，12 h 酯酶活性下降至初始的70%左右；在pH 7.38～9.18 的范围内，24 h 仍保留70%以上的初始活性。说明此酶在碱性条件下具有良好的稳定性，能够很好的适应pH 的变化，是一种耐碱性酯酶。

2.3.6 生化试剂对重组酯酶Est924 的影响 酶促反应速率会受化学物质的影响。表1 的结果显示，多数金属离子对Est924 表现为不同程度的抑制作用，Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Co2+、Al3+、Cr2+等的活性 分 别 为80.1%、 90.2%、 86.2%、 68.4%、31.3%、64.1%、78.2%。Fe3+以及表面活性剂Tween-80和Triton X-100等对Est924有不同程度的激活作用，酶活性分别为127.2%、107.1% 和140.0%。金属螯合剂EDTA 对酯酶Est924 表现为激活作用，说明酯酶Est924 是非金属酶，其催化活性不依懒于金属离子。

图6 温度对重组酯酶Est924稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on stability of Est924

图7 pH对重组酯酶Est924稳定性的影响Fig.7 Effect of pH on stability of Est924

2.4 重组酯酶Est924对邻苯二甲酸酯的降解能力

以DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP 为底物来研究酯酶对PAEs降解作用，TLC结果如图8所示。图中对照组条带为PAEs，条带的明暗代表着PAEs 量的多少。实验组5、7、9 中PAEs 条带已基本消失，DPrP、DBP 和DPP 基本被降解完全；实验组1 和3 中PAEs 条带明显变淡。以上结果表明重组酯酶Est924 对DMP、DEP、DPrP、DBP 和DPP 具有很好的降解能力。实验组11 中PAEs 条带与对照组12 相比变淡，但还比较明显，说明该酶对DnHP 的降解能力较弱。仔细观察实验组发现，在1、3、5、7、9 的PAEs 条带下方、点样点上方位置，有新条带产生，而在对照组中没有。推测，新条带是PAEs 经水解后产生的单酯，重组酯酶Est924对邻苯二甲酸酯的降解作用是通过逐步脱酯化反应实现的。

表1 生化试剂对酯酶Est924 活性的影响Table 1 Effect of the various chemical reagents on activity of Est924

3 讨 论

邻苯二甲酸酯是一类全球性的重要环境污染物。其中，短链烷基酯（C1～C4）的溶解度比长链同系物高，毒性更大［30］。美国环保局（EPA）将邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸正二辛酯（DOP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、DBP、DEP、DMP 等6 种PAEs 列为优先控制的有毒污染物，中国环境监测总站将DEP、DMP 和DOP 等3 种PAEs 列为优先控制污染物［31］。因此，找到广谱高效降解PAEs 且具有良好环境适应性的降解酶尤为重要。

本研究利用宏基因组技术从土壤中挖掘出新酯酶Est924，并研究了其酶学性质以及对环境污染物PAEs 的生物降解。通过对Est924 进行序列分析，推测活性位点与丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸形成的催化三联体有关，同时在活性丝氨酸位点周围含有典型的保守五肽结构G-X-S-X-G，这说明Est924 属于酯酶家族。底物特异性结果显示，重组酯酶Est924 对p-NPC4 的活性最高，对p-NPC2 的活性为50%，对p-NPC6 和ρ-NPC8 活性非常低，而当碳链长度大于10 时几乎没有活性，这与酯酶作用底物的碳链长度小于10 具有一致性［32］。重组酯酶Est924 的最适温度为55 ℃，在30～60 ℃温度范围内，相对酶活性均在60%以上；该酶在25 ℃和30 ℃处理24 h 后，保留80%以上的活性，在40 ℃孵育12 h后仍保留约50%的酶活性。这表明该酶具有很好的温度适应性和较好的热稳定性。重组酯酶Est924在pH 8.34时活性最高，在pH 7.38～9.18 的范围内，相对酶活在80%以上；在pH 7.38～9.18 的环境下处理24 h，仍保留70%以上的酶活性。这表明该酶是一个耐碱酶，且在中性至碱性条件下有很好的适应性。研究重组酯酶Est924 对PAEs 的降解能力发现，该酶对DMP、DEP、DPrP、DBP 和DPP 均具有很好的降解能力。以上研究数据证明，重组酯酶Est924 是一个具有良好稳定性和环境适应性的耐碱酯酶，且对PAEs的降解具有广谱的底物特异性。

图8 TLC分析Est924对邻苯二甲酸酯的降解能力Fig.8 PAEs degradation ability analysis of Est924 by TLC

目前，也有降解PAEs 碱性酯酶的报道，它们与Est924 有着32%以上的同源性，基本的酶学性质有一些相似之处。其中EstZ1 在pH 7.0～9.5 的范围内维持50%以上的活性，对DEP 有降解作用，对其它PAEs 无水解作用［18］；EstPt1 是一个耐热碱性酯酶，最适温度高达85 ℃，有着良好的热稳定性，但只有水解DBP 的数据［23］；酯酶EstSP1 的最适pH（9.0）高于酯酶Est924，能很好的耐受有机溶剂（甲醇和DMSO），最适温度为40 ℃，在25 ℃下处理2 h，酶活性下降为初始的37%，稳定性较差［33］。近些年，克隆的能降解PAEs 的酯酶/脂肪酶数量还不多。来源于Nocardia erythropolis 的脂肪酶，其最适pH 为8.6，在pH 7.0～8.0 范围稳定，能分解大多数PAEs，底物谱较广，但其氨基酸序列未报道［34］。DphB 是一种冷适应酶，最适温度为10 ℃，能催化DPrP、DBP、DPP 的水解［20］。克隆于Camelimonas sp. M11 的酯酶是一种金属酶，不能水解DMP，当pH 大于8.0 时该酶几乎没有活性［19］。BDS4 是一个对PAEs 和阿魏酸酯均具有降解 作 用 的 酯 酶，能 水 解3 种 短 链PAEs［24］；BaCEs04 最适温度为60 ℃，高于酯酶Est924，在pH 5.5～8.0 范围内稳定，只能水解PAEs（C1 ～C4） 到 相 应 的 单 酯［25］。来 源 于Acinetobacter sp.M673的酯酶［26］与Est924底物谱类似，该酶最适反应pH 为7.5，当pH 值超过6.0 和9.0 时，酶活性急剧下降。酯酶GoEst15 具有广谱的底物特异性，能够水解几乎所有的PAEs，在pH 7.5～8.0 条件下处理不到2 h，几乎失活，在40 ℃活性迅速下降［29］，其pH和温度稳定性有待提高。

值得注意的是，现阶段所报道的酯酶多水解PAEs 的一个酯键，生成单酯；仅有个别酶能水解两个酯键，如GoEst15 能将PAEs 水解为相应的单酯，与GoEstM1 共表达后将单酯水解为邻苯二甲酸［29］；从Bacillus sp. K91 基因组克隆了一个酯酶基因CarEW 能水解邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）的两个酯键生成邻苯二甲酸［35］。本文Est924 具有良好的酶学性质，但其对PAEs 的降解机制需要继续深入研究。后续我们将利用突变技术对Est924定向改造，获得更优良的突变酶，同时阐述其对PAEs 的降解机理，从而获得更好的应用前景和理论研究基础。