纳米铜对小油菜（Brassica chinensis L.）种子发芽和幼苗生理生化特性的影响

2020-12-04付宇童孙彤王林徐应明梁学峰孙约兵

农业环境科学学报 2020年11期

付宇童，孙彤，王林，徐应明，梁学峰，孙约兵*

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030；2.农业农村部环境保护科研监测所，农业农村部产地环境污染防控重点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室，天津300191）

铜纳米颗粒（Copper nanoparticles，Cu NPs）具有较高的导热性、导电性及抗微生物特性，被广泛应用于陶瓷、抗菌剂、润滑油和涂料等许多工业产品中[1]。在其生产、运输、使用及处置过程中将不可避免地进入土壤中，并被植物吸收进入食物链，因此关注Cu NPs 释放到环境中对生态系统及人类健康的潜在影响是十分必要的。李芳芳等[2]研究发现，粒径为10～30 nm Cu 粉使肋骨条藻中叶绿素含量降低，0.1 mg·L-1Cu NPs 对肋骨条藻细胞生长抑制率达50%。范功端等[3]证明了0.3～1.3 mg·L-1Cu NPs 会显著抑制斜生栅藻生长，降低叶绿素含量，2.0～3.3 mg·L-1Cu NPs 使斜生栅藻几乎停止生长且出现细胞破裂现象。Lee等[4]观察到Cu NPs对绿豆和小麦幼苗的生长造成负面影响，且绿豆比小麦更为敏感。Tamez等[5]研究表明，Cu NPs会抑制西葫芦生长，200 mg·kg-1Cu NPs使植物根组织抗坏血酸酶活性降低80%。Zhang 等[6]研究发现1 mg·L-1Cu NPs 会激发小麦体内参与脯氨酸代谢的相关基因表达。Apodaca 等[7]发现50～100 mg·L-1Cu NPs 处理会改变食用豆营养价值。上述研究表明，Cu NPs 对植物的影响因其本身性质、浓度及植物物种等的不同，表现出的毒性效应各有差异。

小油菜（Brassica chinensisL.）是我国种植面积和范围最广的蔬菜品种之一，有关其对Cu NPs 毒性响应的研究较少。本文选择小油菜为研究对象，探究Cu NPs 对小油菜种子发芽率、根茎伸长情况，以及幼苗超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的影响，分析了Cu NPs 在小油菜幼苗体内的吸收累积，利用透射电子显微镜观察根部的形态结构变化，以期为Cu NPs的安全评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小油菜种子购自广州长合种子有限公司，发芽率为95%。Cu NPs 粒径为10～30 nm，纯度≥99.9%，比表面积为6.99 m2·g-1，利用透射电子显微镜（JEM-2010，日本）对Cu NPs进行表征，见图1。

图1 Cu NPs透射电镜图Figure 1 Transmission electron microscope（TEM）of Cu NPs

1.2 试验设计

1.2.1 Cu NPs悬浮液的制备

将Cu NPs 粉末加入超纯水中，超声（100 W，40 kHz）1 h，使Cu NPs 粉末可以均匀分散于超纯水中形成悬浮溶液备用，将超声后的悬浮液置于磁力搅拌器上搅拌，使之成为均匀的悬浊液[8]。

1.2.2 预试验

设置4 个Cu NPs 浓度梯度：0、2、20、200 mg·L-1，每个处理3 个重复，培养4 d 后，测量种子发芽数量（种子露白即被认为发芽）、根长和茎长（以胚轴与根之间的过渡点区分根长和茎长），并计算Cu NPs 对种子根抑制率分别为10%和50%时的浓度值，即IC10和IC50[8]。

抑制率=（A-B）/A×100%

式中：A为对照组小油菜种子根伸长或茎伸长，cm；B为各浓度Cu NPs 处理下小油菜种子根伸长或茎伸长，cm。

预试验结果以浓度-抑制率绘制曲线，进行回归分析，并根据回归方程计算Cu NPs 对根伸长及茎伸长抑制率为10%和50%的浓度值，即IC10和IC50。

回归方程依据y=A×ln（x）+B 或y=Cx3+D，其中A、B、C、D为曲线常数。

1.2.3 正式试验

根据预试验结果，在Cu NPs 对小油菜根伸长抑制率10%～50%范围内，设置浓度为0、1、2、4、6、8 mg·L-1和10 mg·L-1，取各浓度的Cu NPs悬浊液6 mL 置于铺有一层滤纸、内径为12 cm 的无菌培养皿中，每个处理均设8 个重复。分别接入小油菜种子各20 粒，盖好培养皿，置于25 ℃恒温恒湿培养箱中培养4 d[8]。暴露培养结束时，测定各处理组种子的发芽数量、根茎伸长量、根茎抑制率、Cu 含量、抗氧化酶活性以及根细胞微观形态。

1.3 测定方法

选取小油菜幼苗根部鲜样固定于2.5%（质量分数）戊二醛固定液中，经0.1 mol·L-1磷酸缓冲液清洗，乙醇逐级脱水，环氧丙烷置换，进行树脂浸透包埋，在烘箱中聚合。将包埋块置于超薄切片机（Leica ultra⁃cut R，德国）上进行切片，染色后通过透射电子显微镜（JEM-1230，日本）观察并拍照[9]。

抗氧化酶活性的测定方法参考文献[10]。称取0.1 g 植物鲜样加入50 mmol·L-1磷酸缓冲液冰上匀浆，4 ℃8 000g离心10 min，上清液即为粗酶液。POD 活性测定采用愈创木酚法，CAT 活性测定采用高锰酸钾滴定法，SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法。

收集小油菜幼苗后，蒸馏水清洗3 遍，杀青，置于65 ℃下烘干至恒质量、粉碎。称取植物样品于消煮管中，加入8 mL HNO3加盖静置12 h，放入消解炉（Di⁃giBlock ED54，中国）中消解，80 ℃消解1.5 h，120 ℃消解1.5 h，150 ℃消解3 h，去塞，180 ℃消解至管内液体余1 mL后取出，加超纯水定容至50 mL，加塞摇匀，Cu含量采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国）进行测定[11]。

1.4 数据分析

利用Excel 2010 对试验数据进行统计，使用DPS数据处理系统的单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较分析（LSD 法）对不同处理间差异显著性进行比较（P＜0.05），数据以平均值和标准差表示，并采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同剂量Cu NPs对小油菜种子发芽的影响

本试验中，不同剂量Cu NPs 处理下的小油菜种子发芽率与对照（超纯水）相比降低了0.7%～4.3%，各处理发芽率均无显著差异（P＞0.05）（图2），Cu NPs 对小油菜种子发芽率的抑制率方程为y=-2.3lnx+98.0（R2=0.923）。这与Stampoulis 等[12]、向垒等[8]研究结果一致。Stampoulis 等[12]研究发现，1 000 mg·L-1Cu NPs处理不会对西葫芦种子发芽造成影响。向垒等[8]研究表明0.2～8 mg·L-1纳米氧化铜不会对白菜种子发芽率造成影响。这是由于种子发芽过程中主要由胚内进行养分供应，所选用的小油菜种子有种皮，具有选择透过性，其在保护胚胎免受有害外部因素的影响中起着非常重要的作用，可以降低外界污染对种子的毒害作用，只有受到极严重的污染时，种子发芽率才会受到明显影响[13]。

图2 Cu NPs对种子发芽的影响Figure 2 Effects of Cu NPs on seed germination

较低浓度的Cu NPs 会对小油菜的根伸长造成明显影响（图3A），当Cu NPs 添加量为1 mg·L-1时，小油菜根伸长量与对照组相比增加了3.3%，不存在显著性差异（P＞0.05）。Pradhan 等[14]研究表明，0.05～1 mg·L-1Cu NPs 会促进绿豆根、茎伸长。陈晓华等[15]研究结果说明，Cu 属于过渡金属，是植物生长的必要微量营养元素，低浓度下可作为酶的辅助因子促进藻类的光合作用，从而促进其生长。当Cu NPs 添加量为2、4、6、8、10 mg·L-1时，小油菜的根伸长量受到抑制，分别降低了10.7%、14.7%、49.5%、50.8%、59.9%，当Cu NPs的添加量为6 mg·L-1时，抑制率达到50.0%（图3B）。范功端等[3]指出0.3～1.3 mg·L-1Cu NPs 培养条件下斜生栅藻的生长被抑制，处理组细胞密度总体上显著低于对照组（P＜0.05），2 mg·L-1Cu NPs 完全抑制斜生栅藻、四列藻和椭圆小球藻的生长。Kouhi 等[16]研究发现纳米锌会抑制6 种高等植物物种（萝卜、甘蓝型油菜、多花黑麦草、紫花苜蓿、玉米和黄瓜）的根系生长。Hussain 等[17]研究了30 mg·L-1Cu NPs 对苦艾蒿生长发育的影响，结果表明在处理7 d 后苦艾蒿根长受到抑制。

Cu NPs 对小油菜茎伸长量的影响整体呈现先促进后抑制的趋势（图4A），Cu NPs 添加量为1 mg·L-1时，小油菜茎伸长量增加了2.2%，但与未添加Cu NPs处理组没有显著性差异（P＞0.05）；2 mg·L-1Cu NPs 对小油菜茎伸长有促进作用，较对照显著增加了9.1%；而当Cu NPs 浓度≥4 mg·L-1时，会对小油菜茎伸长量造成显著抑制作用（P＜0.05），与对照相比，小油菜茎伸长量降低4.8%～15.8%（图4B）。Saharan 等[18]研究也发现，添加0.08～0.12 mg·L-1Cu NPs 会促进番茄茎伸长量增加，但是随着添加量的增加促进作用不断降低。王磊等[19]研究了Cu 离子对莴苣柱高的影响，结果表明5 mg·L-1Cu 离子处理下莴苣株高产生抑制作用，但不显著（P＞0.05）。

研究发现，小油菜根的伸长与Cu NPs 的暴露之间存在一定的剂量-效应关系，但是小油菜茎伸长没有显示出相同的结果，小油菜根部受到污染物的伤害比其他部位要明显。这可能是由于小油菜种子发芽后，根是面对污染物的第一目标组织，根系会直接与污染源进行接触且对Cu 的吸收能力较强，重金属进入到小油菜根部会抑制根尖细胞有丝分裂，抑制根系正常发育[20]。Cu 被小油菜根部吸收后存在滞留作用，阻碍了Cu 离子向茎、叶部位的运输，这也是植物抵御重金属胁迫的方式之一，因此毒性症状会更多地出现在根中而不是枝条中[21]。纳米颗粒的毒性可能归因于两种不同的作用，一是基于化学成分的化学毒性，也就是释放的金属离子；二是颗粒的表面、大小、形状引起的应力或刺激。虽然Rajak等[22]研究结果显示Cu NPs 溶解释放的Cu 离子含量较低，但正如Kouhi等[16]在评价纳米氧化锌对植物毒性效应时所提到的，探究金属纳米颗粒对植物的毒性作用时，必须要考虑金属离子的毒性。研究结果表明，Cu NPs 会比纳米氧化锌表现出更强的毒性，推测Cu NPs 之所以会对小油菜根部造成更大程度的损伤，可能是由于选择的Cu NPs 粒径更小，更容易透过细胞壁达到质膜，对小油菜根部的细胞组织造成破坏[13]。

图3 Cu NPs处理对根伸长的影响Figure 3 Effects of Cu NPs on root elongation

图4 Cu NPs对茎伸长的影响Figure 4 Effect of Cu NPs on shoot elongation

2.2 小油菜幼苗Cu含量和根细胞微观特征的变化

不同浓度Cu NPs 处理下小油菜幼苗中Cu 含量见图5。整体上小油菜幼苗Cu 含量随Cu NPs 添加量增加而增加（y=1.8x3+8.7，R2=0.850）。与对照相比，当Cu NPs 浓度≤2 mg·L-1时幼苗体内Cu 含量增加不显著（P＞0.05），而当Cu NPs 浓度≥4 mg·L-1时小油菜幼苗体内Cu 含量显著增加（P＜0.05）。这是由于随着Cu NPs 添加量的增加，其在水中的溶解量也会增加，导致更多的Cu离子进入小油菜体内[23]。

根据前文研究结果，选择10 mg·L-1Cu NPs 处理下的小油菜根系部位进行植株包埋超薄切片处理，观察Cu NPs 对根系细胞的穿透效应（图6）。从图中可以观察到添加10 mg·L-1Cu NPs 使细胞出现比较普遍质壁分离现象，这可能是由于Cu NPs 的添加对植物细胞造成损伤，ROS作为副产物攻击蛋白质、核酸、脂质等，引起细胞氧化应激。秦世玉[24]的研究出现了类似结果，谢华[25]也在研究中发现重金属胁迫会使植物细胞出现质壁分离趋向解体的现象。同时在小油菜根部细胞中，观察到高电子密度的沉积物，与Cu NPs进行形态对比，推测可能是Cu NPs 通过运输作用进入到细胞中[26]。纳米颗粒可以通过共质体和质外体两条途径进入植物组织。与共质体相比，质外体的阻力较小，大多数在植物中的分布位点主要是细胞壁和细胞间隙，说明质外体途径可能是主要运输方式[27]。对植物来说，细胞壁是纳米颗粒进入细胞中的一大障碍。理论上纳米材料的粒径只有小于细胞壁孔径才能进入到细胞中。也有研究表明纳米氧化铜及纳米氧化锌等会被细胞内化，纳米氧化锌会诱导细胞壁产生较大的孔，然后通过这些孔进入到植物组织中[28]。在玉米根细胞中观察到含有纳米氧化铜的包内体，推测纳米颗粒还可以通过胞吞作用进行跨膜运输[29-30]。

图5 不同Cu NPs处理下小油菜幼苗体内Cu含量的变化Figure 5 Cu content in the seedling of Brassica chinensis L.under the treatments of Cu NPs

图6 根部细胞的扫描电镜图Figure 6 Transmission electron microscope（TEM）of root cell

2.3 Cu NPs对小油菜幼苗酶活性的影响

植物体内SOD、CAT、POD 等保护酶系统具有清除活性氧自由基的功能，以减轻活性氧对植物的伤害[24]。当植物受到外界胁迫时，SOD 是植物防御机制的一道重要防线。如图7A 所示，当Cu NPs 添加量为1 mg·L-1时，SOD 活性达到最高，显著高于对照和其他处理（P＜0.05）；当Cu NPs 添加量为2～6 mg·L-1时，SOD 活性变化较对照相比变化不显著（P＞0.05）；当Cu NPs 添加量≥8 mg·L-1时，与对照相比SOD 活性被显著抑制（P＜0.05），降低了50.6%～64.0%。Hussain等[17]研究表明Cu NPs 会使苦艾蒿SOD 活性下降。崔静等[31]的研究也得到类似结果，证明金鱼藻暴露于0～8 mg·L-1Cu NPs 后其SOD 活性呈现先升高后降低的变化趋势。Nair等[32]研究发现，50 mg·L-1纳米氧化铜会降低鹰嘴豆茎中Cu-Zn SOD的基因表达，而Antonio等[33]结果显示Cu NPs 会增加番茄叶片SOD 活性。由于Cu是SOD合成的必要微量元素，低浓度（1 mg·L-1）Cu NPs处理促进了SOD的表达，SOD活性增加。还可能是由于重金属对植物的毒害作用增加了细胞中活性氧的含量，当污染程度较低时植物体内SOD会被激活，从而消除多余的活性氧来保持植物体内平衡[32]。而随Cu NPs浓度增加，SOD已经不能消除其产生的毒害作用，或者是由于酶本身是一种蛋白质，Cu NPs 会对蛋白质造成损伤，使SOD受到抑制。

CAT 是一种广泛存在于植物体内的抗氧化酶。植物中CAT 主要与抗逆性及氧化衰老等生理过程有关，植株中过氧化氢有双重作用，一方面适量的过氧化氢可以作为诱导一系列防御机制的信号，另一方面过量过氧化氢会导致过氧化损伤，对植物组织造成损伤[34]。CAT 作为调节植物内氧化还原动态平衡的重要酶，在植物抗毒害作用方面起着重要作用。本研究中，不同剂量Cu NPs 处理下小油菜幼苗CAT 活性变化不明显（P＞0.05）（图7B）。与对照相比，1～6 mg·L-1Cu NPs 处理下小油菜幼苗CAT 活性增加1.6%～8.8%，这可能是因为在Cu NPs 污染下，CAT 有协助SOD 一起抵御自由基氧化的功能[35]。而当Cu NPs 浓度≥8 mg·L-1时小油菜幼苗CAT 活性降低了4.7%～5.9%，这与Trujillo-Reyes 等[35]的结论类似。Nair 等[36]研究表明纳米氧化铜没有对绿豌豆茎中CAT 基因表达造成显著影响（P＞0.05）。Hong 等[37]研究了Cu NPs对莴苣和苜蓿的毒性效应，显示CAT 活性总体上随Cu NPs 浓度增加均呈现出先增高后降低的趋势。这是由于外界毒性较低的情况下，CAT抵抗外界环境的胁迫作用导致活性增加，但是当污染物添加浓度增加时，过量的Cu 可能通过Cu 离子代替铁离子的活性中心而导致CAT 失活[32]。但Hernández-Hernández 等[38]研究发现，10 mg Cu NPs 及壳聚糖共同作用下番茄CAT活性会提高111%，这可能是壳聚糖包封的Cu NPs颗粒毒性较高，而试验选用Cu NPs 粉末，可能由于选取浓度较小、毒性较低没有显著激活CAT 基因表达。在植物中，活性氧作为副产物，分布在不同细胞区室中的各种代谢途径中，在生理稳态条件下，这些分子通常被限于特定区室中的不同抗氧化防御成分清除。CAT 主要在光呼吸和脂肪酸的β-氧化过程中参与清除过氧化氢[15]。CAT 没有表现出SOD 类似的变化趋势，可能由于本试验采取室内暗培养，小油菜幼苗没有进行光呼吸等过程。

图7 不同Cu NPs处理下幼苗酶活性的变化Figure 7 The enzyme activity of seedlings under different Cu NPs treaments

POD 是在植物逆境条件下酶促防御反应系统的关键酶之一，它与SOD、CAT相互协调配合，使植物体内保持正常的动态平衡[39]。Cu NPs 对小油菜幼苗POD 酶活性造成不同程度的抑制作用（图7C）。与对照相比，小油菜幼苗POD 降低了4.4%～59.3%。当Cu NPs 浓度≥2 mg·L-1时，小油菜幼苗POD 活性显著受到抑制（P＜0.05），当Cu NPs添加量为10 mg·L-1时，幼苗POD 活性最低。POD 是植物体内普遍存在的一种酶，其对环境污染反应十分灵敏。解凯琳等[40]的研究表明，重金属胁迫会对植物表现出强烈的毒性，抑制植物的生理生化过程。POD 活性的显著变化表明Cu NPs 引起的氧化胁迫超出了小油菜幼苗的抗氧化能力。植物体内ROS 的产生速率大于清除速率，活性氧无法及时被清除导致大量积累，对植物的细胞膜、细胞器造成伤害，进而使保护酶活性不断降低。小油菜体内POD 活性未显示出与CAT 活性相似的变化趋势，这可能与过氧化氢直接转化为过氧化物的量有限相关[12]。