人羊膜上皮细胞在去表皮真皮上构建组织工程皮肤及其性状研究

江蕾微

（贵州省人民医院 贵州 贵阳 550001）

人羊膜上皮细胞（hAECs）是一种较为特殊的细胞，其拥有与常规干细胞相似的特征，与其他干细胞相比具有较全面的多分化潜能等多方面优点，可将其作为本次研究的种子细胞来进行大规模培养。去表皮真皮组织（DED）因其保留原人体皮肤组织糖胺多糖和蛋白质等等基膜成分，能够像正常皮肤细胞一样诱导种子细胞的分化和增殖，对组织工程技术具有较大的应用价值[1]。为研究hAECs 构建组织工程皮肤的效果及其性状，本院将该细胞植入DED中，并应用气-液界面培养法进行培养。其研究成果如下：

1.材料与方法

1.1 选用材料

培养基DMEM （美国Gibco 生物公司），胎牛血清（美国Hyelone 生物公司），表皮生长因子（EGF，美国PeproTech 生物公司），波形蛋白抗体（Denmark 生物公司），层粘蛋白抗体（DAKO,Denmark），试剂盒（晶美生物工程有限公司），CO2细胞培养箱（Thermo公司），荧光显微镜与倒置生物显微镜（Olympus公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-40B 型）。

1.2 方法

首先需制备hAECs 的悬液，制备具体流程为：在新生儿家属同意下，应用机械剥离方式剥离新生儿新鲜胎盘上胎盘羊膜组织，应用低浓度胰蛋白酶分离以上hAECs。将胎盘上提取的羊膜组织用磷酸盐缓冲液（PBS）进行清洗，剪成细小碎块后加入0.25%胰蛋白酶，按照同一方向轻轻摇晃培养容器，以收集并消化贴附与容器壁的细胞，收集单细胞悬液，加10%胎牛血清的培养基停止上述步骤。将残存于培养容器壁上的细胞进行吹打，调整离心机至1000r/min，5min 来分离收集到的细胞组织。根据离心后的分层去除上清液，将剩余细胞置于hAECs 完全培养基中制成完整的悬液，计数并调整细胞浓度至5×106/ml，待用。

后制备成纤维（FB）细胞悬液，制备流程为：收集健康未成年男性正常包皮组织后进行培养，期间运用PBS 液清洗2 ～3遍。加入0.25%胰蛋白酶，按照同一方向轻轻摇晃培养容器，以收集并消化贴附与容器壁的细胞，加入含8%FBS 的DMEM 培养基停止上述步骤。将残存于培养容器壁上的细胞进行吹打，调整离心机至1000r/min，5min 来分离收集到的细胞组织。根据离心后的分层去除上清液，将剩余细胞置于含10%FBS 的DMEM 培养基中制成细胞完整的悬液，计数并调整细胞浓度至5×105/ml，待用。

两种悬液制备完成后，可构建组织工程皮肤，具体流程为：将DED 基膜面朝上置于六孔板中，按1mL/孔的剂量加入hAECs的培养基，并将100uL/孔剂量的FB 细胞悬液按照顺序接种于前5 孔中，确保能与后面加入的hAECs 悬液有效反应，最后1 孔植入PBS 作为对照组。将六孔板植入5%CO2，36.7℃的环境下，以保证Fb 细胞能够紧密贴合在DED 真皮面上。放置一夜后翻转DED 至基底膜朝上，用与FB 细胞悬液相同用量的hAECs 悬液加入已加入FB悬液的孔洞中，后每将hAECs完全培养基加入6个孔，直到能刚好浸没DED 为止，将得到的样本置于CO2浓度为5%、36.7℃环境中进行为期3 ～4 天的培养，使得hAECs 与DED 融合。调整用于DED 中细胞组织生长的培养基的量，保证hAECs 在液面状态的情况下与空气接触，应用气-液面培养2 周时间。

2.结果

应用气-液面培养2 周后肉眼观察到DED 上出现明显膜状物，且该膜质地较光滑。并通过光镜清晰可见DED 上出现5 ～8层新生表皮结构，且层次、角质层分明，表皮突以乳头状的形式深入真皮层，且伸入的情况长短不一。经PAS 染色，能清晰观察到上皮细胞与DED 表面之间出现了一条平稳的紫红色分界线，此时检查 样本PAS 为阳性。应用透射电镜检测样本皮肤组织的结构能得出，该样本组织与人类皮肤组织结构相似，在其细胞质内可明显观察到线粒体和角蛋白细丝等结构,两相邻细胞的细胞膜上出现与一般人体皮肤组织结构相似的细胞桥粒结构。新生表皮与DED 之间可见基底膜结构，且致密层和透明层清晰可见，同时在DED 基膜处进表皮一侧能观测到半桥粒结构。

3.讨论

通过以上研究可知，通过将hAECs 悬液接种于DED 中并应用气-液界面等方式在与常人内环境相似的场所进行培养，于2周后DED 上明显趋于平滑，且有一层明显的膜状物，该膜状物便是hAECs 通过增殖与分化转化而来的新生表皮结构，同时在细胞质内可明显观察到线粒体和角蛋白细丝等结构,在相邻的细胞膜上可见细胞桥粒结构。这证明经hAECs 形成的膜结构与DED 原组织的结构相似。

综上所述，通过将hAECs 植入DED 中能够培养出与正常人体皮肤结构作用功能、甚至增殖及分化标记分子相似的组织工程皮肤，可将该类细胞进一步研究，有利于未来对人类皮肤缺失的修复治疗[2-3]。