无创性分子标志物用于新生儿坏死性小肠结肠炎早期诊断的研究进展

王雪芳，胡勇

(上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院 新生儿科，上海 200062)

新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)作为新生儿重症监护病房(NICU)最常见的胃肠道急症，是导致早产儿和低出生体重儿(LBW)死亡的重要原因之一。近年来，随着极低出生体重儿(VLBW)、LBW病死率的下降，NEC的发病率逐渐升高。在中国，VLBW和LBW的NEC发生率分别为4.5%和2.5%，Ⅱ、Ⅲ期NEC死亡率为41.7%[1]。NEC发病急、进展快，早诊断、早治疗对提高NEC患儿生存率和远期治愈率有着极为重要的意义。依据NEC的病因学和临床症状，目前正在开展的早期临床诊断研究可以归化为两大类：一是检测粪便中肠道菌群谱及粪便挥发性有机化合物(VOCs)；二是测定血浆、粪便和尿液中的炎症标志物，如肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、尿血清淀粉样蛋白A(SAA)、粪钙卫蛋白(FC)、肠碱性磷酸脂酶(IAP)及血清C反应蛋白(CRP)、肠三叶因子(ITF)、白介素(IL)-6、IL-8、IL-10等。作者着重就从粪便、尿液中寻找无创性分子标志物用于早期诊断NEC的最新研究进展进行综述。

1 I-FABP

I-FABP是一种小的胞质蛋白，主要存在于小肠的肠上皮细胞中，在细胞分裂后被释放入血。I-FABP很容易从肾脏排出，因此可以在组织损伤后数小时内通过尿液检测[2]。NEC的特点是肠壁完整性缺失，因此I-FABP也许是一种较有前途的生物标志物。Gregory等[3]研究了70对病例与对照，NEC组发病7 d内的尿I-FABP中位浓度均高于非NEC组。使用98例婴儿(49对病例与对照)的一个子集进行分析，其NEC组的尿样均在诊断NEC的3 d内获得。其中，尿I-FABP中位浓度在NEC组中较高，并且在所有Bell分期中均显著升高。受试者工作特征曲线(ROC曲线)显示：在NEC发病的7 d内，I-FABP>13.3 ng·ml-1预测NEC的敏感性为60%，特异性为78%；在NEC发病的3 d内，I-FABP>13.9 ng·ml-1预测NEC的敏感性为65%，特异性为84%。由此认为尿I-FABP可能是NEC发病的7 d内一个有用的预测因子，在NEC发病的3 d内更具有预测力。Schurink等[4]检测了37例(男24例、女13例)新生儿的血浆I-FABP和尿I-FABP，发现NEC组(22例)的血浆I-FABP和尿I-FABP水平明显高于非NEC组(15例)，I-FABP在发病后8 h内最高，并随着时间的推移逐渐下降。诊断NEC的临界值为血浆I-FABP 9 ng·ml-1和尿 I-FABP 218 ng·ml-1。Coufal等[5]招募了42例疑似NEC的患儿和12例健康儿作为对照，通过ELISA检测其尿液标本，发展为NEC的患儿中，尿I-FAPA浓度在NEC早期就明显升高，其阳性预测值达100%。然而，Yang等[6]对I-FABP用于NEC诊断相关的13个研究的结果进行了Meta分析，认为血浆I-FABP是诊断NEC的一种很有前途的生物标志物，具有很高的特异性，但由于其敏感性中等，实用性受到了限制。而尿I-FABP和尿I-FABP/Cr对诊断价值不大，尿I-FABP联合其他分子标志物对高危早产儿的临床应用可能具有更大的应用价值。由于目前实验中纳入研究的样本量都较小，因此需要更多高质量的研究来确定I-FABP是否可成为早期识别NEC的分子标志物。

2 SAA

SAA是一种急性期蛋白，在刺激性细胞因子诱导下由肝脏和肾脏迅速合成。Reisinger等[7]对62例临床怀疑NEC的新生儿(29例最终诊断为NEC)进行尿I-FABP、尿SAA、FC定量检测。采用多变量Logistic回归模型计算尿I-FABP+尿SAA和尿I-FABP+FC联合应用的诊断准确率。结果显示尿SAA联合尿I-FABP不能提高尿I-FABP的诊断准确率。随后，Reisinger等[8]对这29例新生儿NEC进行尿I-FABP、尿SAA、尿C3a、尿C5a和FC的测定，结果显示，与轻度NEC(定义为内科NEC或Ⅰ、Ⅱ期NEC)相比，严重NEC(定义为手术性NEC、致死性NEC或Ⅲ期NEC)新生儿尿SAA水平显著升高。根据Bells修正标准，确定了Ⅱ期和Ⅲ期NEC组SAA的最佳临界值为40.7 ng·ml-1。同一组还报道了尿SAA和血清血小板计数联合应用可将鉴定灵敏度提高到94%。这些结果提示，尿SAA可能是识别严重NEC的一个潜在标志物，联合血小板计数可提高SAA测定的准确性。

3 FC

FC是一种由钙和铁合成的36 kDa的蛋白质，可反映肠道炎症情况。Yoon等[9]的研究结果示NEC组较非NEC组FC水平明显升高。MacQueen等[10]随访了30个早期X线检查排除NEC的患儿的粪便标本，并根据其最终结局分组。结果显示新生儿NEC组初诊及随访FC水平均高于无NEC组。Zhang等[11]采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定早产儿NEC组(17例)和非NEC组(23例)的FC浓度，NEC组FC中位值明显高于非NEC组，且NEC Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期差异有统计学意义。同时，FC水平与血小板计数呈负相关，与CRP呈正相关。无独有偶，Abdelkader等[12]检测了29例NEC患儿与29例非NEC患儿的粪便样本，与非NEC组相比，NEC组FC水平高得多，且FC水平与NEC分期呈正相关。但也有一些研究者如Van Zoonen等[13]认为，早产儿出生后的第1周FC浓度高，个体间差异大，广泛的个体内变异排除了在高危婴儿NEC早期检测或预测中连续使用FC的可能性。总之，FC可能是筛查高危新生儿亚群中NEC的一个有效的生物标志物。然而，由于FC是一种非特异性炎症标志物，因此对NEC的诊断没有特异性。但是将其与其他指标相结合可能会增加其特异性。Reisinger等[7]对62例临床怀疑NEC的新生儿(29例最终诊断为NEC)进行尿I-FABP、尿SAA、FC定量检测。采用多变量Logistic回归模型分析尿I-FABP与FC联合应用的诊断准确率。结果显示FC和尿I-FABP的联合应用显著提高了准确性。尿I-FABP与FC联合检测的敏感性为94%，特异性为79%，但不能区分NEC Bell Ⅲ期和Bell Ⅱ期。由此可见，多种分子标志物联合用于诊断NEC的可行性可成为未来研究的一个重要方向。

4 VOCs

NEC炎症标志物的检测目前主要集中在I-FABP、SAA、FC等，和腹部X线平片相比，粪便炎症标志物的检测特异性比较差，多数处于临床研究阶段，没有直接应用于临床诊断。目前临床诊断NEC的主要方法还是依赖于腹部X线平片和腹部超声检查，这种检测是基于肠道内气体产生量，特别是门静脉内的气体含量。鉴于NEC临床检查以肠道内气体产生量为主要指标，肠道内某些挥发性有机化合物似乎有望成为诊断NEC的标志物。De Meij等[14]认为，从临床症状出现前2～3 d起，NEC组(13例)的粪便VOCs谱可与非NEC组(14例)相鉴别，利用eNose进行VOCs分析有可能成为早期预测NEC的非侵入性工具。Garner等[15]从新生儿重症监护病房内早产儿的每日粪便样本(共65份)中提取了224种不同的挥发性有机物。非NEC组的VOCs数量随年龄增长而增加，而NEC组诊断前后的几天内，VOCs的提取量减少。此外，在非NEC组中检测到的4种特定酯(2-乙基己基乙酸酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯)，在NEC发生前4 d内的所有粪便样本中始终未被检测到。初步研究表明，从粪便中提取VOCs可用于鉴别NEC高危婴儿。Probert等[16]从1 326例婴儿中采集了7 000多份粪便标本，并对32例确诊NEC婴儿诊断前的标本进行了检测，NEC组和非NEC组的VOCs存在差异，在确诊前3～4 d 似乎充当了NEC的分子标志物。但在确定个别挥发性有机化合物作为潜在的NEC分子标志物的有用性之前，还需要更大的样本量、进一步的数据集验证。

5 粪便中肠道菌群谱

细菌在NEC的发病机制中起关键作用，无菌动物不能发展成NEC[17]。NEC患儿肠道菌群是否有其独特性并能用于辅助诊断？许多研究者为此作了大量研究。Morrow等[18]检测了11例NEC婴儿和21例非NEC婴儿的粪便和尿液样本，认为早期肠道微生物失调的特征和潜在益生菌的存在与否，可以作为非侵入性生物标志物，共同预测早产儿的NEC。结合早期的微生物因素，他们获得了一个非常高的NEC预测值(88%)，但鉴于该研究的样本量较小，且在单一人群中进行，应谨慎进行这一初步估计。Zhou等[19]对取自12例NEC婴儿和26例年龄匹配的非NEC婴儿的共312个粪便样本进行了16sRNA基因的纵向分析，结果提示，肠道微生物中最常见的是肠杆菌属，95%的样本中都有肠杆菌，这表明该菌可能代表早产儿早期(0～60 d)的纵向核心属。早期发病的NEC患者与对照组的微生物群的差异最为明显。在接近NEC发病时，早期发病的NEC患者中，梭形芽孢杆菌的狭窄梭菌的丰度显著高于对照组，晚期发病的NEC患者中，变形菌属中的大肠杆菌/志贺氏菌在发病前呈上升趋势，并在发病前6 d显著高于对照组。晚期发病的NEC患者在发病前1～3 d，来自变形杆菌属的阪崎肠杆菌也明显高于对照组。因此，与NEC相关的特异性感染可能因婴儿发病年龄的不同而不同。Warner等[20]研究了122例婴儿的2 492份粪便样本，其中28例婴儿患NEC，94例非NEC婴儿作为对照，NEC患儿粪便中的微生物群落结构与对照组相比有显著差异，这些差异只有在出生后的第1个月才出现。发展为NEC的婴儿中，变形杆菌(肠杆菌科)的比例增加，阴性杆菌和梭菌-阴性杆菌的比例降低。这些关联性在妊娠小于27周的婴儿的队列中最强。Roz′e等[21]对15例NEC患儿和57例非NEC患儿进行了16sRNA基因测序，结果显示，在属级，梭状芽孢杆菌与NEC显著相关。Pammi等[22]通过系统回顾及Meta分析发现，早产儿患NEC前的微生物失调表现为变形杆菌相对丰度增加，厚壁菌和拟杆菌相对丰度降低。现有研究揭示了在属级水平上早产儿患NEC前的肠道微生物失调，其结果是否能用于临床诊断尚需进一步研究。

6 IAP

IAP作为肠道内表达的内源性蛋白质，是无创检测的理想选择。Rentea等[23]利用新生大鼠模型证明早产及配方喂养与抑制IAP的表达和活性有关，而这两者都可能增加NEC的风险，对有NEC风险的新生儿早期肠内补充IAP可能有治疗作用。Heath等[24]检测了136例早产儿的粪便，分别用荧光法和免疫法测定IAP的酶活性和相对丰度，认为粪便中IAP蛋白含量高、IAP酶活性低与NEC的诊断有关，可作为NEC的有用生物标志物，并认为IAP是唯一能够区分NEC和败血症的生物化学物质。

除上述无创性标志物外，尿液来源的尿补体C3a和C5a[8]、前列腺素E2主要尿代谢物[25]以及粪便来源的粪乳铁蛋白[26]等也有利于早期发现NEC。

近几十年来，NEC分子标志物研究取得了稳步进展。上述标志物对早期诊断NEC、判断其严重程度及治疗方案选择有一定的指导意义，但是目前尚无法确定一个比较准确的诊断临界值及其相关的敏感度、特异性，大样本、多中心研究将是今后努力的方向。