新型药物载体外泌体的研究现状与展望

何梦铖，胡春梅，张治元，丁一楠，唐秋莎

(东南大学医学院 病理生理学系，江苏 南京 210009)

Pan等[1- 2]于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现外泌体，在1987年他们将这些功能性囊泡定义为外泌体(exosome)。外泌体，一种细胞外囊泡亚型，是细胞衍生的生物聚合物，直径30～120 nm，密度在1.13～1.19 kg·L-1之间，具有独特的结构及生化和机械性能[3]。现已知几乎所有培养的细胞都能够分泌出外泌体，它还存在人体的体液中, 包括尿液[4]、唾液[5]、血液[6]、脑脊液[7]、乳汁[8]等。这些囊泡包含的生物分子如mRNA、miRNA、DNA、蛋白质和脂质，能够支持外泌体协助细胞间沟通。近年来由于外泌体独特的生物特性，相关的研究逐步增多，外泌体被广泛应用于临床的诊断和治疗中。此外，作为内源性的纳米材料，外泌体在人体内递送药物方面也已被证实具有巨大优势。本文作者就近年有关外泌体作为药物载体的研究进展作回顾与总结，并讨论外泌体的研究前景。

1 外泌体的形成与生物特性

外泌体来源于早期细胞的内吞作用产生的小囊泡，小囊泡在细胞内形成核内体，在高尔基体的帮助下，晚期核内体中积聚大量“货物”，生成大量的腔内小泡(intralumenal vesicles, ILVs)，形成多泡体(multivesicular body, MVB)。这种转化伴随着一个货物分类过程，将可溶性分子组分招募到腔内小泡中，例如细胞质蛋白和脂质[9]。不同的MVBs有着不同的命运，它们可能与溶酶体融合，导致内囊泡结构和内容物的降解；或与母细胞的质膜融合，导致内囊泡以胞外方式释放到细胞外基质，即外泌体[10]。

外泌体内包含有大量不同种类的蛋白质、 mRNA等生物活性物质。由于外泌体是由内吞途径产生的，它们包含Tsg101分子等内泌体成分。外泌体包含的蛋白有细胞骨架成分(微管蛋白、肌动蛋白和膜联蛋白)、多泡体生成相关的蛋白(Alix、TSG101)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、细胞内运输分子(Rab-GTP酶家族和SNARE)、膜分子[整合素、黏附分子1(ICAM-1)]、热休克蛋白(HSP70、HSP90)以及与外泌体来源相关的细胞特异性蛋白[11- 13]，其中CD9和CD63常被当作外泌体的分子标志[14]。此外，已有研究报道常见的脂类如磷脂酰乙醇胺、二酰基甘油、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸、双磷酸腺苷酸、胆固醇和鞘磷脂存在于外泌体中[15]。而外泌体表面丰富的蛋白使其可以与靶细胞膜上的特异性蛋白结合，使其具有靶向性[16]。

外泌体有3种可能影响受体细胞的方法。(1) 内吞：内吞途径是导入外泌体的传统方式，有助于影响受体细胞中的信号传导途径；(2) 受体-配体相互作用：通过这种方式外泌体表面分子与位于靶细胞质膜(plasma membrane, PM)上的分子相互作用；(3) 直接融合：直接与靶细胞的细胞膜融合释放 mRNA、miRNA 从而进入细胞质[17]。外泌体通过上述方式与相邻细胞或远处细胞相互作用,将其所包含的内容物在不同细胞间传递，在细胞行为以及细胞通讯中起到了重要作用。

目前在人体各个系统中都发现了外泌体的存在，证实外泌体在疾病的诊疗方面具有重要作用:(1) 外泌体在肿瘤疾病诊断方面的作用。尽管许多细胞都能释放外泌体，但是有数据表明肿瘤细胞外泌体分泌量更加突出[18]，所以外泌体在肿瘤诊断方面表现出了高度的特异性。例如胰腺癌患者血清外泌体中miRNA-17-5p和miRNA-21的含量相较于正常人明显升高[19]。(2) 外泌体在心血管系统疾病诊断方面的作用。Ribeiro-rodrigues等[20]发现缺血心肌细胞的外泌体含有大量促血管生成的miR-143和miR-222。含有miR-143和miR-222的外泌体能够通过刺激毛细血管样结构的形成增强屏障特性以及刺激新血管生成而促进心脏血管生成。(3) 外泌体在神经系统诊断方面的作用。由于外泌体可以通过血脑屏障，外泌体在人体神经系统中也有重要意义。脑内神经元、内皮细胞等均可分泌外泌体。Goetzl等[21]比较了阿尔茨海默病患者与正常人血浆神经源性外泌体成分，发现阿尔茨海默病患者的低密度脂蛋白受体相关蛋白-6、热休克因子-1和阻遏因子1-沉默转录因子表达水平均显著低于正常人。

2 外泌体作为药物载体的优势

目前在临床和医学实验中常用药物载体主要为病毒载体和非病毒载体，但是它们本身都具有不可忽视的局限性。病毒载体如逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒等，它们的特异性较低、安全性较弱、靶向性不足以及潜在致癌性都是限制病毒载体临床应用中的重要问题[22]。而对于非病毒载体，药物包载效率低、缺乏靶向性的问题同样不可忽视[23]。

在新型的药物载体中，外泌体受到青睐。已知外泌体与传统药物载体相比，有以下优势：(1) 来源广泛。几乎所有培养的细胞都能分泌外泌体，它还广泛存在于人体体液中。(2) 良好的生物相容性和非免疫原性。自源性的外泌体经修饰后作为药物载体，降低了发生免疫反应的概率，在体内不易被清除，保证了足够的循环时间，从而提高了利用效率[24]。(3) 纳米尺度。纳米级分子的外泌体能够逃脱单核吞噬细胞系统的快速清除[25]，可以利用增强渗透滞留(enhanced permeability and retention effect, EPR)效应渗入到肿瘤内发挥作用[26]，还能因此通过包括血脑屏障在内的绝大多数生物屏障系统。(4) 稳定性高。外泌体能够保护包载的药物在人体复杂的环境中不被降解，随后通过膜融合将药物直接运输至细胞质中。(5) 一定的的靶向性。由于外泌体是由细胞产生的，具有跨膜蛋白和表面受体等特异性蛋白，可避免或促进特定(目标)细胞的识别和相互作用[27]。(6) 外泌体膜修饰方式多样。(7) 外泌体作为载体可以使药物摄取量更大、循环时间更久、药物释放更加持续[28]。(8) 应用没有异倍体风险[29]。

3 外泌体的提取与纯化

作为药物载体，高纯度和数量是外泌体广泛应用的首要条件，所以外泌体的提取纯化方法一直都是研究的热点之一。不同方法提取出来的外泌体的纯度、活性、产量均不相同，选择合适的提取方法是外泌体应用的前提条件。

3.1 差速超速离心法

差速超速离心法是目前最经典、也是应用最广泛的提取方法。通过逐渐增大离心力逐步去除血清中的死亡细胞、细胞碎片，得到的肉眼可见淡黄色沉积物即为外泌体，用PBS重悬后保存。 但是这种方法比较繁琐、耗时，高速度离心可能导致颗粒与污染物和其他蛋白质融合，影响外泌体的物理特性和蛋白质组学分析的敏感性[30]。巨大的离心力有可能引起样品中外泌体丢失，导致外泌体产量减少。

3.2 超滤离心法

超滤离心法使用具有预定孔径和孔密度的超滤膜对上清进行分离提取外泌体。相比差速超速离心法，超滤离心法不仅省时省力，而且回收率和纯度更高，对于在无细胞样品(如尿液、血清和细胞培养基)中分离外泌体尤为有效[31]。但是这种方法得到的外泌体纯度低，而且离心过程中部分外泌体会黏附在滤膜上，影响外泌体的产量[32]。

3.3 蔗糖垫超速离心法

因为蔗糖的密度(1.12～1.18 g·ml-1)与外泌体的密度(1.13～1.19 g·ml-1)相当，所以可产生缓冲作用。首先通过300×g和10 000×g的超速离心预处理，去除上清中的细胞碎片和坏死细胞。随后加载到30%蔗糖溶液中，100 000×g超速离心，去除高密度(1.22 g·ml-1)的蛋白质污染物，这种方法得到的外泌体完整性更好，纯度更高[33]。但是同样存在与外泌体密度相等的杂质无法去除的问题。

3.4 尺寸排阻色谱法(SEC)

SEC是基于大小的分离技术。确定好胶体固定相孔径的大小，混合物中流体动力学半径较小的颗粒能够通过孔，而半径大于孔的颗粒则无法进入孔中。SEC分离血浆中外泌体可达到较高的纯度，但是生产效率仍有待商榷[31]。

3.5 聚合物沉淀法

聚合物沉淀法是通过加入沉淀试剂来改变外泌体的溶解度，使外泌体能够通过膜或者低速离心的方式得到外泌体的沉淀物。相比其他方法，聚合物沉淀法不需要专门的设备，简便易操作，但是会产生更多的非外泌体杂质，比如杂质蛋白质和聚合材料[34]。

3.6 微流控技术

微流控技术是通过特有的微流控芯片，结合粒径、生物膜电荷分布特点、黏弹性等其它物理特性，来达到分离外泌体的目的。其它提取方法需将分离与鉴定过程分隔开，既耗时又增加了外泌体污染的机会，而微流控技术灵敏度高，可直接在体液中对外泌体进行检测和定性，适用于所有体液中的外泌体[31]。但该领域仍处于起步阶段，对技术要求高，更适用于微量样品，相比较应用于分离与提纯，微流控技术用于检测无疑是更好的选择。

4 外泌体作为药物载体的应用

4.1 基因类药物

基因类药物主要分为miRNA、siRNA、mRNA，由于RNA干扰(RNA interference)的特异性基因抑制具有巨大的治疗应用潜力，近年来研究人员通过多种方法来达到miRNA和siRNA在体内的高效靶向传递的效果。研究发现多种miRNA参与神经修复过程，而脑卒中患者的神经修复能力弱，将狂犬病病毒糖蛋白(RVG)融合到溶酶体相关膜糖蛋白2b修饰的外泌体中，可以将miR-124递送到脑卒中后的梗死部位，以促进神经修复[35]。利用口腔癌患者颊部组织中miR-185显著降低的特点，Wang等[36]利用间充质干细胞来源的外泌体运输miR-185，粘贴于致癌剂二甲基苯蒽诱导的口腔潜在恶性疾病模型的颊部病变上，口腔恶性疾病的发生率显著降低，免疫组化也显示处理的病变中增殖标志物PCNA和血管生成标志物CD31表达明显下降，证明了其抗炎抗新生血管功能。叶酸(folic acid, FA)受体是一种在癌细胞上高表达的细胞表面糖蛋白，在癌症选择性治疗上具有优越性，但FA-siRNA疗法具有内核体逃逸困难的问题。Zheng等[37]通过荧光显微镜技术证实，与没有外泌体的FA-siRNA相比，包绕于外泌体的FA-siRNA通过外泌体受体介导的胞质传递能力避免了核内体的捕获，达到siRNA的干扰效果，证实了外泌体装载siRNA在肿瘤治疗中的潜力。

4.2 小分子药物

4.2.1 紫杉醇(paclitaxel, PTX) PTX 是一种天然的抗肿瘤药物，但是其毒性以及疏水性限制了其应用，所以对于载体的选择极为重要。将骨髓来源的SR8947与PTX共同孵育，培养出包载PTX的外泌体。将加载有PTX的外泌体和CFPAC-1细胞共同注入小鼠体内，癌细胞的增殖受到明显的抑制。此外骨髓来源的MSCs并不是唯一保留摄取或释放PTX特性的基质细胞，即使从脂肪组织或真皮中分离出的其他基质细胞也具有这种特性[38]。

4.2.2 姜黄素 姜黄素是一种存在于姜黄根茎中的天然多元酚，具有抗炎、抗恶性肿瘤、抗氧化等广泛作用，但其肠肝代谢不明显、稳定性差、全局性清除快、水溶性差的特征限制了它的应用[39]。Aqil等[40]在裸鼠体内种植了人宫颈癌细胞，以磷酸盐缓冲为对照，分别单用外泌体、姜黄素或载有姜黄素的外泌体喂食，结果显示，仅装载有姜黄素的外泌体喂食的大鼠肿瘤受到明显抑制。这证明了外泌体在作为姜黄素载体方面具有极其明显的优势，克服了姜黄素清除快、代谢不稳定的缺点。

4.3 蛋白类药物

蛋白质药物具有分子质量大、不能口服等缺点，而外泌体由于良好的生物相容性和稳定性成为优先考虑的载体。Haney等[41]在体外将高效抗氧化剂过氧化氢酶包载到外泌体中，经鼻内给药后在帕金森小鼠的大脑中检测到大量外泌体，证实了含有过氧化氢酶的外泌体可以将大量酶传递到目标神经元，提供抗氧化应激的神经保护活性。

5 不足与展望

尽管外泌体在临床应用上有非常好的前景，但在研究初期仍然存在一些问题:(1) 产率低下，分离提纯难。目前最常用的分离方式是差速超速离心法，该方法提取外泌体的纯度高但操作复杂、耗时长且成本昂贵，解决方案包括优化现有的提取方法、将多种提取方法相结合用于分离与提纯。有研究人员依据外泌体优异的生物学特性，提出了外泌体-模拟纳米囊泡(exosome-mimetics)的设想，这样的药物传递系统具有外泌体的优点，而且生产过程更容易[42]。(2) 靶向性不足。外泌体具有一定的靶向性，但是在复杂的人体环境中，外泌体本身的靶向性不足以实现大多数的靶向给药需求，需要通过化学修饰使外泌体表面表达特定的靶向分子。但是，修饰后的外泌体是否会引起机体免疫反应、是否保持原有功能尚不确定。后续研究中成熟完善的靶向修饰技术是实现外泌体广泛临床应用的重要前提。(3) 载药方式不完善。目前最常用的外泌体载药方式是转染法和电穿孔法。转染法是通过转染剂或让药物与外泌体共同孵育将药物转进外泌体，但残留的转染试剂可能会影响封装过程和改变外泌体的细胞功能[43]。电穿孔法则是在外泌体外增加一个外界电场，能量达到一定程度会在外泌体表面电击出可修复的小孔，增加外泌体膜通透性，允许药物、DNA、RNA等小分子物质进入外泌体[44]。但电穿孔法容易引起外泌体聚集，对药物和外泌体的完整性会产生影响[45]，对此我们可以考虑在电穿孔过程中加入一定的膜保护剂，减轻外泌体的聚集。

近年来，关于外泌体的研究报道不断增多，大多数是将外泌体用作药物载体。在癌症化疗药物靶向性方面，外泌体因其免疫原性小、靶向潜力大，有望成为重要的化疗药物载体。目前存在常用外泌体提取方法产量低、外泌体自身靶向性弱、载药效率较低等问题。通过外泌体模拟囊泡可能有助于提高外泌体产量，未来研究的重点除了要完善外泌体制备方法，还应将目前限于实验室的外泌体研究实现产业化加以推广应用。随着研究进展，外泌体作为药物载体一定会促进临床疾病的诊断与治疗。