雷公藤红素通过调控GINS2表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞活力和凋亡的影响*
2020-12-03黄芳石志军雷燕杨擎宇
黄芳, 石志军, 雷燕, 杨擎宇
雷公藤红素通过调控GINS2表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞活力和凋亡的影响*
黄芳1, 石志军2△, 雷燕1, 杨擎宇1
(1华中科技大学医院药剂科,2华中科技大学生命科学与技术学院,湖北 武汉 430074)
探讨雷公藤红素对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)活力和凋亡的影响及其分子机制。采用低、中、高剂量的雷公藤红素处理KFB。采用CCK-8实验和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡。RT-qPCR和Western blot检测GINS复合物亚基2 (GINS2)的表达。将KFB分为si-NC组、si-GINS2组、Exp+pcDNA组和Exp+pcDNA-GINS2组,按照上述方法检测细胞活力和凋亡的变化。雷公藤红素处理后KFB活力降低,细胞凋亡率升高, GINS2表达降低,并呈显著的剂量依赖关系(<0.05)。敲减表达后, KFB活力降低,细胞凋亡率升高(<0.05);过表达GINS2可部分逆转雷公藤红素对KFB活力和凋亡的影响(<0.05)。雷公藤红素通过下调GINS2可抑制KFB活力,促进细胞凋亡。
雷公藤红素;GINS复合物亚基2;瘢痕疙瘩;成纤维细胞;细胞活力;细胞凋亡
瘢痕疙瘩(keloid)是皮肤科和外科最常见皮肤纤维增生性疾病,以皮肤损伤后成纤维细胞过度增殖、胶原蛋白过度沉积为特征。瘢痕疙瘩在增生过程中往往伴有瘙痒和疼痛,且复发率、术后畸形发生率高,易引起心理困扰,严重影响瘢痕疙瘩患者生活质量[1]。雷公藤红素(tripterine)来源于中药雷公藤的根皮,具有广泛的生物学活性。现代研究表明,雷公藤红素除具有抗炎、抗氧化等药理作用外,还通过抑制细胞存活、侵袭迁移、血管生成或促进细胞凋亡在多种恶性肿瘤中表现出显著的抗肿瘤作用[2-4]。GINS复合物亚基2 (GINS complex subunit 2,)是近年发现的癌基因,研究显示敲减的表达对鼻咽癌和甲状腺癌细胞具有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用[5-6]。瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts, KFB)的异常增殖和浸润与肿瘤细胞特性类似,但雷公藤红素和GINS2能否影响KFB的生物学行为尚不清楚。本研究通过观察不同浓度雷公藤红素对KFB的活力、凋亡及GINS2表达的影响,探讨其潜在的分子机制,以期为雷公藤红素在瘢痕疙瘩临床治疗中的应用提供实验资料。
材料和方法
1 材料
DMEM培养基(HyClone);雷公藤红素(批号111946-201501,纯度≥97%,中国食品药品检定研究院);小干扰RNA (si-GINS2)及其阴性对照(si-NC)、GINS2过表达载体(pcDNA-GINS2)以及空载体pcDNA(上海生工公司);细胞计数试剂盒(CCK-8)、膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒、Trizol试剂和放射免疫沉淀实验裂解液(上海碧云天公司);兔抗人GINS2抗体、兔抗人细胞周期素D1 (cyclin D1)抗体、兔抗人p21抗体、兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体及山羊抗兔IgG(上海艾博抗公司)。
2 方法
2.1细胞培养和实验分组参照季江等[7]的实验方法从我院手术切下的瘢痕疙瘩、健康人皮肤组织分离KFB和正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblasts, NFB),采用DMEM培养基在37℃、5% CO2的培养箱中培养。每周换液2~3次,当细胞融合度达到70%时进行传代,取第4~8代细胞用于后续实验。
采用含1、2.5和5 μmol/L雷公藤红素的培养液孵育KFB,依次标记为低、中、高剂量实验(Exp-L、Exp-M和Exp-H)组,同时设置对照(control)组。按照下述方法检测细胞活力、凋亡及凋亡相关蛋白和GINS2表达水平,确定后续实验雷公藤红素浓度。
为证实雷公藤红素是通过调控GINS2表达进而影响KFB活力和凋亡,将KFB分为si-NC组(转染si-NC)、si-GINS2组(转染si-GINS2)、Exp+pcDNA组(转染pcDNA后用5 μmol/L的雷公藤红素干预处理)和Exp+pcDNA-GINS2组(转染pcDNA-GINS2后用5 μmol/L的雷公藤红素干预处理)。
2.2CCK-8法检测细胞活力将KFB按照每孔1×104cells接种到96孔板,当细胞贴壁后,按照上述实验分组进行干预处理后,每孔添加10 μL的CCK-8试剂,反应2 h。以空白孔调零,采用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度()值。
2.3流式细胞术检测细胞凋亡将KFB以每孔2×105cells接种于6孔板,当细胞贴壁后,按照上述实验分组进行干预处理后,消化收集细胞,按照凋亡试剂盒说明书进行操作,分别加入5 μL的annexin V-FITC和5 μL的PI,混匀后室温避光20 min,上机检测细胞凋亡率。
2.4RT-qPCR检测GINS2的mRNA表达Trizol试剂提取NFB细胞和各组KFB总RNA,反转录合成cDNA,再以cDNA为模板,利用GINS2引物、SYBR Green PCR Master Mix试剂进行qPCR扩增。GINS2的上游引物序列为5′-CAGAAATGTCGCCTGCTCC-3′,下游引物序列为5′-GGATTTCGTCTGCCTTCG-3′;内参照GAPDH的上游引物序列为5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游引物序列为5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。采用2-ΔΔCt法分析GINS2 mRNA的表达水平。
2.5Western blot检测GINS2、cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax的蛋白表达放射免疫沉淀实验裂解液提取NFB细胞和各组KFB总蛋白,收集蛋白样品测定其浓度和纯度。取适量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,常规湿法转膜,室温封闭膜1 h,Ⅰ抗室温孵育膜1 h,Ⅱ抗室温孵育膜1 h,化学发光显色以及目的蛋白灰度值分析。以GAPDH内参照,分析目的蛋白表达水平。
3 统计学处理
采用SPSS 18.0进行统计分析。每组设置3个平行实验,独立重复3次,实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-检验。以<0.05为差异有统计学意义。
结果
1 雷公藤红素对KFB活力及cyclin D1和p21蛋白表达的影响
雷公藤红素低、中、高剂量组在24~72 h时KFB活力和cyclin D1蛋白表达低于对照组, p21蛋白表达高于对照组(<0.05);雷公藤红素中、高剂量组在24~72 h时KFB活力和cyclin D1蛋白表达低于雷公藤红素低剂量组, p21蛋白表达高于雷公藤红素低剂量组(<0.05);雷公藤红素高剂量组在24~72 h时KFB活力和cyclin D1蛋白表达低于雷公藤红素中剂量组,p21蛋白表达高于雷公藤红素中剂量组(<0.05),见图1和表1。
Figure 1. The expression of cyclin D1 and p21 proteins in keloid fibroblasts detected by Western blot.
表1 雷公藤红素对瘢痕疙瘩成纤维细胞活力及cyclin D1和p21蛋白表达的影响
*<0.05control group;#<0.05Exp-L group;&<0.05Exp-M group.
2 雷公藤红素对KFB凋亡的影响
雷公藤红素低、中、高剂量组KFB凋亡率和Bax蛋白表达高于对照组,而Bcl-2蛋白表达低于对照组(<0.05);雷公藤红素中、高剂量组KFB凋亡率和Bax蛋白表达高于雷公藤红素低剂量组, Bcl-2蛋白表达低于雷公藤红素低剂量组(<0.05);雷公藤红素高剂量组KFB凋亡率和Bax蛋白表达高于雷公藤红素中剂量组, Bcl-2蛋白表达低于雷公藤红素中剂量组(<0.05),见图2和表2。
Figure 2. Effect of tripterine on apoptosis of keloid fibroblasts. A: the expression of apoptosis-related proteins; B: flow cytometryic analysis of keloid fibroblast apoptosis.
表2 雷公藤红素对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响
*<0.05control group;#<0.05Exp-L group;&<0.05Exp-M group.
3 GINS2在KFB中的表达
RT-qPCR和Western blot结果显示, KFB中GINS2的mRNA和蛋白表达均显著高于NFB(<0.05),见图3。
Figure 3. The expression of GINS2 in keloid fibroblasts (KFB). A: relative mRNA expression of GINS2 in KFB; B: relative protein expression of GINS2 in KFB. Mean±SD. n=9. *P<0.05 vs normal skin fibroblasts (NFB).
4 雷公藤红素对KFB中GINS2表达的影响
雷公藤红素低、中、高剂量组KFB中GINS2的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(<0.05);雷公藤红素中、高剂量组KFB中GINS2的mRNA和蛋白表达水平显著低于雷公藤红素低剂量组(<0.05);雷公藤红素高剂量组KFB中GINS2的mRNA和蛋白表达水平显著低于雷公藤红素中剂量组(<0.05),见图4。
Figure 4. Effect of tripterine on GINS2 expression in keloid fibroblasts. A: effect of tripterine on mRNA expression of GINS2 in keloid fibroblasts; B: effect of tripterine on protein expression of GINS2 in keloid fibroblasts. Mean±SD. n=9. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs Exp-Lgroup; &P<0.05 vs Exp-M group
5 敲减GINS2表达对KFB活力和凋亡的影响
si-GINS2组KFB中GINS2蛋白表达水平显著低于si-NC组(<0.05),提示转染si-GINS2后KFB中GINS2表达受到抑制;敲减表达后, KFB在24~72 h的活力降低,凋亡率升高, cyclin D1和Bcl-2蛋白表达降低, p21和Bax蛋白表达升高(<0.05),见图5和表3。
Figure 5. Effects of GINS2 knockdown on the cell cycle-related protein expression and apoptosis in the keloid fibroblasts. A: the expression of GINS2, cell cycle-related proteins and apoptosis-related proteins; B: flow cytometryic analysis of keloid fibroblast apoptosis.
表3 敲减GINS2表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞活力和凋亡的影响
*<0.05si-NC group.
6 过表达GINS2逆转雷公藤红素(5 μmol/L)对KFB活力和凋亡的作用
与对照组比较,雷公藤红素组KFB中GINS2蛋白表达降低, 24~72 h细胞活力降低,细胞凋亡率升高, cyclin D1和Bcl-2蛋白表达降低, p21和Bax蛋白表达升高(<0.05);与Exp+pcDNA组比较, Exp+pcDNA-GINS2组的KFB中GINS2蛋白表达升高, 24~72 h细胞活力升高,细胞凋亡率降低, cyclin D1和Bcl-2蛋白表达升高, p21和Bax蛋白表达降低(<0.05),见图6和表4。
Figure 6. GINS2 over-expression reversed the effect of tripterine on the cell cycle-related protein expression and apoptosis in the keloid fibroblasts. A: the expression of GINS2, cell cycle-related proteins and apoptosis-related proteins; B: flow cytometryic analysis of keloid fibroblast apoptosis.
表4 GINS2过表达逆转雷公藤红素对瘢痕疙瘩成纤维细胞活力和凋亡的作用
*<0.05control group;#<0.05Exp+pcDNA group.
讨论
雷公藤是我国传统的中药材,性味苦寒,具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血等功效,常用于风湿性关节炎、红斑狼疮、肾炎等的治疗。雷公藤红素是从雷公藤根皮中提取的一种天然的五环三萜化合物,研究显示雷公藤红素对耐药结肠癌细胞表现为显著的细胞毒作用,其可诱导肿瘤细胞DNA损伤、周期阻滞和凋亡[8]。雷公藤红素可能通过抑制细胞有氧糖酵解对胃癌细胞具有抗肿瘤作用[9]。此外,雷公藤红素诱导FANCD2降解提高高级别胶质瘤对顺铂的敏感性[10]。雷公藤甲素是雷公藤主要活性的另一有效成分,其对瘢痕疙瘩发展的抑制作用早已被证实[11-12],但雷公藤红素是否对瘢痕疙瘩形成具有抑制作用上未可知。本研究采用不同浓度的雷公藤红素处理KFB发现,雷公藤红素可明显降低KFB的活力,促进细胞凋亡,并呈显著的剂量依赖关系。cyclin D1是一种重要的周期蛋白,其表达上调促进细胞增殖,而p21则具有反作用。雷公藤红素通过下调cyclin D1表达对肺癌细胞具有显著的抗肿瘤作用[13]。Bcl-2和Bax是细胞凋亡过程中的关键因子,当细胞受到凋亡信号刺激时,Bax移位至线粒体膜,降低Bcl-2/Bax比值,导致细胞色素C从线粒体释放到细胞质进而激活caspase途径促进细胞凋亡[14]。载有薏苡仁油和雷公藤红素的转铁蛋白功能微乳剂对宫颈癌细胞增殖、血管生成抑制作用以及凋亡诱导与调控Bcl-2和Bax表达有关[15]。本研究发现雷公藤红素呈剂量依赖关系抑制cyclin D1和Bcl-2表达,促进P21和Bax表达,提示雷公藤红素能够抑制KFB活力,促进细胞凋亡。
GINS2是一种核酸复制因子,与GINS3和GINS4共同组成GINS复合体家族,在DNA复制起始、细胞周期调控中起关键作用。临床研究表明,GINS2在多种恶性肿瘤中的致癌基因作用[16-17]。GINS2在宫颈癌中表达上调,其高表达与总生存期、复发、盆腔淋巴结转移有关,可能是早期宫颈癌预后不良的独立危险因素[18]。卵巢癌中GINS2亦呈高表达,下调GINS2可显著抑制肿瘤细胞增殖和生存能力,诱导细胞周期阻滞和凋亡[19]。此外,GINS2高表达有助于维持乳腺癌细胞的干细胞特性,并与乳腺癌的进展和不良预后相关[20]。本研究发现KFB的GINS2表达较NFB的GINS2表达显著增加,雷公藤红素呈剂量依赖关系降低KFB的GINS2表达水平,推测雷公藤红素对KFB的活力抑制与凋亡促进作用与下调GINS2表达有关。抑制表达后KFB的细胞活力、cyclin D1和Bcl-2的表达显著降低,细胞凋亡率、P21和Bax的表达显著升高,而过表达GINS2则部分逆转雷公藤红素对KFB活力、凋亡以及相关蛋白表达的影响。提示雷公藤红素对KFB的活力和凋亡的影响与下调GINS2表达有关。
综上所述,雷公藤红素通过下调GINS2表达对KFB具有抑制活力、促进细胞凋亡的作用,提示雷公藤红素是一种潜在的治疗瘢痕疙瘩药物,这为雷公藤红素在瘢痕疙瘩治疗中的应用提供了实验资料。
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Effects of tripterine on viability and apoptosis of keloid fibroblasts by regulating GINS2
HUANG Fang1, SHI Zhi-jun2, LEI Yan1, YANG Qing-yu1
(1,,430074,;2,,430074,)
To explore the effects of tripterine on the viability and apoptosis of keloid fibroblasts (KFB) and its molecular mechanism.The KFB were treated with tripterine at low, medium and high doses. The cell viability and apoptosis were measured by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. RT-qPCR and Western blot were applied to determine the expression of GINS complex subunit 2 (GINS2). The KFB were divided into si-NC group, si-GINS2 group, Exp+pcDNA group and Exp+pcDNA-GINS2 group, and the changes of cell viability and apoptosis were measured using the above methods.After treatment with tripterine, the viability of KFB was decreased, the apoptotic rate was increased, and GINS2 expression was decreased in a dose-dependent manner (<0.05). After knockdown of, the viability of KFB was decreased, and the apoptotic rate was increased (<0.05). Over-expression of GINS2 partially reversed the effect of tripterine on the viability and apoptosis of KFB (<0.05).Tripterine inhibits KFB viability and promotes the apoptosis by down-regulating GINS2.
Tripterine; GINS complex subunit 2; Keloid; Fibroblasts; Cell viability; Apoptosis
R751; R363
A
10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.017
1000-4718(2020)11-2043-07
2020-05-12
2020-07-02
国家自然科学基金资助项目(No.21574050)
Tel: 18971075901; E-mail: 364211065@qq.com
(责任编辑:余小慧,罗森)