低极性人参皂苷F4抑制SHI-1和K562白血病细胞增殖及诱导分化的研究*

李弯， 高瑞兰， 余潇苓， 尹利明， 唐比强， 兰高琛， 兰金剑， 赵燕娜

低极性人参皂苷F4抑制SHI-1和K562白血病细胞增殖及诱导分化的研究*

李弯， 高瑞兰， 余潇苓， 尹利明， 唐比强， 兰高琛， 兰金剑， 赵燕娜△

（浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006）

观察低极性人参皂苷F4（F4）抑制人单核系白血病细胞SHI-1和红系白血病细胞K562增殖及诱导分化的作用。以不同浓度（0、40、80和120 mg/L）的F4处理SHI-1和K562细胞， MTT比色法和半固体集落形成实验检测F4对细胞增殖的抑制作用；瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞趋向分化的形态；流式细胞术和免疫荧光法检测分化相关抗原CD11b和CD14阳性表达率及其荧光反应强度；免疫细胞化学和Western blot法分析SHI-1细胞分化相关转录因子PU.1和K562细胞红系分化相关GATA-1和γ-globin的蛋白表达水平； RT-qPCR法检测PU.1和GATA-1的mRNA表达变化。与对照（0 mg/L）组比较， F4能够抑制SHI-1和K562细胞增殖（<0.01），诱导白血病细胞趋向分化，表现为细胞核/质比缩小，染色质粗糙，核仁减少，可见空泡， SHI-1细胞核有扭曲。SHI-1细胞CD11b和K562细胞CD14阳性表达率显著升高（<0.01），且免疫荧光反应从弱阳性转变为强阳性；但SHI-1细胞CD14和K562细胞CD11b阳性表达率无显著变化。同时， F4上调PU.1和GATA-1的mRNA和蛋白表达水平及γ-globin的蛋白表达水平（<0.05）。低极性人参皂苷F4具有抑制SHI-1和K562白血病细胞增殖及诱导分化的抗白血病作用，其作用可通过调控分化相关PU.1、GATA-1和γ-globin的表达来实现。

低极性人参皂苷F4；SHI-1细胞；K562细胞；细胞增殖；细胞分化

髓系白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，恶性增殖和分化阻滞是其主要的发病机理。目前虽然运用全反式维甲酸诱导分化治疗取得了显著的疗效，但是其仅对急性早幼粒细胞白血病有效，还会出现分化综合征等致命副作用及耐药等问题。因此，寻找低毒高效的天然药物逐渐成为研究的热点。近年研究发现，人参皂苷具有抑制白血病细胞增殖和诱导分化的作用［1-4］，其作用的有效成分尚不明确。有研究报道，低极性人参皂苷F4（F4）具有一定的抗肿瘤作用，且其对正常细胞无不良作用，是相对安全和有效的药物［5］。Chen等［6］显示F4能够抑制人淋巴细胞瘤JK细胞增殖并诱导其凋亡，但是其对髓系白血病细胞的作用尚不明确。本项工作采用F4处理髓系白血病SHI-1和K562细胞，探讨F4抑制白血病细胞增殖及诱导分化的作用，为其深入研究及应用提供实验依据。

材料和方法

1　实验细胞及药物

人单核系SHI-1白血病细胞由江苏省血液病研究所陈子兴教授惠赠，红系K562白血病细胞购自中国科学院上海细胞库，均由浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所保存。人参皂苷F4购自上海融禾医药科技有限公司，经核磁共振谱、质谱、红外光谱和紫外吸收光谱鉴定其结构，纯度>98%，分子式为C42H70O12，分子量为767.01。

2　主要试剂

IMDM培养液购自Gibco；新生牛血清购自杭州四季青公司； PE-CD11b抗体和FITC-CD14抗体购自BD Pharmingen； GATA-1和PU.1抗体购自Cell Signaling Technology； γ-globin抗体购自Santa Cruz；内参照β-actin抗体购自联科生物技术有限公司； RT-qPCR试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司； PCR引物由联川生物技术有限公司合成。

3　主要方法

3.1细胞培养将SHI-1和K562细胞分别培养于含15%和10%新生牛血清的IMDM完全培养液中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中，隔天换液1次，取对数生长期细胞用于后续实验。

3.2MTT比色法取对数生长的SHI-1和K562细胞，调整细胞悬液浓度至1×108/L，接种于96孔培养板，分别加入不同浓度的F4，每孔2×104个细胞（200 μL），重复6孔。F4终浓度分别为0、40、80和120 mg/L。上述培养体系置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养72 h后，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，孵育4 h。离心去上清，每孔加入150 μL DMSO，微量振荡器振荡5 min，使结晶完全溶解，酶标仪检测490 nm波长的吸光度（）值，计算F4对各组细胞活力的抑制率（%）=（对照组值-实验组值）/对照组值×100%。实验重复5次。

3.3半固体集落形成实验计数并调整SHI-1和K562细胞悬液浓度为5×106/L，进行半固体集落培养，分别加入不同浓度的F4，使F4终浓度为0、40、80和120 mg/L。培养体系为IMDM培养液、30%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/链霉素和0.3%琼脂，每孔2.5×102细胞（0.5 mL），接种于24孔培养板，重复3孔。上述培养体系置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养7 d。倒置显微镜下计数白血病细胞集落数（≥40个细胞），计算F4对各组细胞的抑制率（%）=（对照组集落数-实验组集落数）/对照组集落数×100%。实验重复5次。

3.4瑞氏-吉姆萨染色法取对数生长的SHI-1和K562细胞，调整细胞悬液浓度至1×108/L，接种于6孔培养板，分别加入不同浓度的F4，使F4终浓度为0、40、80和120 mg/L。上述培养体系置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养7 d。收集细胞悬液，经离心涂片机71×离心甩片5 min，制成细胞涂片。常规瑞氏-吉姆萨染色，油镜下放大1 000倍观察细胞形态。实验重复3次。

3.5流式细胞术及免疫荧光法用0、40、80和120 mg/L的F4分别处理SHI-1和K562细胞7 d，收集细胞，PBS洗涤，分别加入PE标记的CD11b和FITC标记的CD14单克隆抗体，室温孵育30 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞仪检测表面标记的阳性细胞率，每个标本检测记录10 000个细胞。DIVA软件作阳性率的分析，实验重复3次。免疫荧光法的细胞处理与抗体标记方法同上，标记荧光抗体的细胞经离心涂片机71×离心甩片5 min，制成细胞涂片，荧光显微镜放大630倍观察细胞。实验重复3次。

3.6免疫细胞化学法用0、40、80和120 mg/L的F4分别处理SHI-1和K562细胞7 d，收集细胞，细胞悬液经离心涂片机71×离心甩片5 min，制成细胞涂片，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100破膜。SHI-1细胞加I抗PU.1， K562细胞加Ⅰ抗GATA-1和γ-globin，置于4℃湿盒孵育过夜，加Ⅱ抗工作液， 37℃孵育30 min，DAB显色10 min。PU.1和GATA-1用苏木精复染， γ-globin用甲基绿复染。中性树脂封片，放大1 000倍油镜下观察出现褐色反应的阳性细胞。阳性程度判断标准：无褐色反应为“-”；褐色浅淡成云絮状为“+”；深褐色凝块状为“+++”；介于两者之间为“++”。随机计数200个细胞，计算不同阳性程度细胞的百分比。实验重复3次。

3.7Western blot法用0、40、80和120 mg/L的F4分别处理SHI-1和K562细胞7 d，收集细胞，加入裂解液提取细胞总蛋白。每孔40 μg总蛋白经10% SDS-PAGE分离，将蛋白条带转移至NC膜上，室温下用5% BSA封闭1 h， SHI-1细胞加PU.1抗体， K562细胞加GATA-1和γ-globin抗体， 4℃孵育过夜，加II抗室温孵育1 h，ECL发光剂显影。采用灰度扫描系统测定并分析目的条带蛋白。实验重复3次。

3.8RT-qPCR法用0、40、80和120 mg/L的F4分别处理SHI-1和K562细胞3 d，收集细胞，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，经逆转录为cDNA，分别采用特异性引物，进行实时荧光定量PCR。内参照β-actin的上游引物序列为5'-CATCAAGGAGAAACTGTGT-5'，下游引物序列为5'-AGGCAACTCGTAACTCTT-3'； PU.1的上游引物序列为5'-CCATAGCGACCATTACTG-3'，下游引物序列为5'-CTCCGTGAAGTTGTTCTC-3'； GATA-1的上游引物序列为5'-CCTCTATCACAAGATGAATGG-3'，下游引物序列为5'-GCCCGTTTACTGACAATC-3'。PCR扩增条件为： 95℃ 3 min； 95℃ 10 s， 60℃ 30 s， 39个循环。实验重复3次。

4　统计学处理

用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　F4抑制SHI-1和K562细胞增殖

MTT比色法结果显示， F4分别处理SHI-1和K562细胞72 h后， 40、80和120 mg/L组的值显著低于0 mg/L组（<0.01）， IC50分别为（132.6±19.0） mg/L和（101.1±7.8） mg/L，见表1。

表1　MTT法检测不同浓度F4对SHI-1和K562细胞活力的抑制作用

**<0.010 mg/L group.

半固体集落形成实验结果显示， F4分别处理SHI-1和K562细胞7 d后， 80和120 mg/L组的集落内细胞数量较对照组明显减少，多为细胞丛或单个细胞，见图1； 40、80和120 mg/L组的集落数显著低于0 mg/L组（<0.01）， IC50分别为（89.5±14.0） mg/L和（64.2±8.9） mg/L，见表2。

Figure 1.　The numbers of cells in SHI-1 and K562 cell colonies were reduced by F4. The arrows indicate clusters or individual cells. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=100 μm.

表2　集落形成实验观察不同浓度F4对SHI-1和K562细胞增殖的抑制作用

**<0.010 mg/L group.

综合参照以上两个实验中F4的IC50，我们将40、80和120 mg/L作为后续实验中F4的低、中、高浓度。

2　诱导SHI-1和K562细胞趋向分化的形态学

结果显示，随着药物浓度的升高，SHI-1和K562细胞出现不同程度的核/质比例缩小，染色质粗糙，核仁减少，可见空泡，SHI-1细胞核有扭曲或折叠，见图2。

Figure 2.　The morphological changes of SHI-1 and K562 cells with differentiation tendency induced by F4. The arrows indicate lower nucleus/cytoplasm ratio and the SHI-1 cells with broad-bean shaped nuclei. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D:120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

3　细胞表面分化相关抗原阳性表达率显著增加

流式细胞术显示，随着药物浓度的升高，SHI-1细胞表面标记CD11b和K562细胞表面标记CD14的阳性表达率均显著高于对照组（<0.01），而SHI-1细胞表面标记CD14和K562细胞表面标记CD11b阳性表达率没有显著变化，见图3。免疫荧光法的结果与流式细胞术结果一致，随着药物浓度的升高，SHI-1细胞表面标记CD11b和K562细胞表面标记CD14的荧光程度逐渐增强，见图4。

Figure 3.　Expression of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. **P<0.01vs control group．

Figure 4.　The fluorescence intensity of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells observed by immunofluorescence method. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=32 μm.

4　F4上调细胞分化相关蛋白的表达

免疫细胞化学染色结果显示，随着药物浓度的升高， F4能够上调SHI-1细胞中PU.1及K562细胞中GATA-1和γ-globin的蛋白表达，见图5、6。

Figure 5.　The protein expression of PU.1 in SHI-1 cells was detected by immunocytochemistry. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

Figure 6.　The protein expression of GATA-1 and γ-globin in K562 cells was detected by immunocytochemistry. A: control group; B: 40 mg/L F4 group; C: 80 mg/L F4 group; D: 120 mg/L F4 group. The scale bar=20 μm.

经40、80和120 mg/L的F4处理， SHI-1细胞表达PU.1蛋白强阳性（“+++”）率显著高于对照组（<0.05或<0.01），见表3； K562细胞表达GATA-1和γ-globin蛋白强阳性（“+++”）率显著高于对照组（<0.05或<0.01），见表4。

表3　F4诱导SHI-1细胞上调PU.1蛋白的表达

*<0.05,**<0.010 mg/L group.

表4　F4诱导K562细胞上调GATA-1和γ-globin蛋白的表达

*<0.05,**<0.010 mg/L group.

Western blot分析结果与免疫细胞化学的结果一致， F4处理后SHI-1细胞表达PU.1及K562细胞表达GATA-1和γ-globin的特异性条带灰度值显著高于对照组（<0.05或<0.01），见图7。

Figure 7.　The protein expression of PU.1 in SHI-1 cells and GATA-1 and γ-globin in K562 cells was analyzed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

5　F4上调细胞分化相关mRNA的表达

RT-qPCR结果显示，与对照组相比， 40、80和120 mg/L组SHI-1细胞PU.1和K562细胞GATA-1的mRNA显著上调（<0.05或<0.01），见图8。

Figure 8.　The mRNA expression of PU.1 in SHI-1 cells and GATA-1 in K562 cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

讨论

近年来低极性人参皂苷的生物学活性研究取得了很大进展，在抗肿瘤、增强免疫力及清除自由基等方面的活性要高于原人参皂苷［7-8］。低极性人参皂苷F4对HL-60白血病细胞有抑制增殖的作用［9］。本研究以人单核系SHI-1和人红系K562白血病细胞为靶细胞，结果显示低极性人参皂苷F4（40~120 mg/L）能够显著抑制SHI-1和K562细胞增殖。白血病细胞集落形成实验以SHI-1和K562细胞群中原始细胞作为观察对象，显示40~120 mg/L的F4能显著减少SHI-1和K562细胞形成集落的数目，抑制其原始细胞的增殖，抑制率达到26.1%~64.2%和35.0%~74.1%。MTT比色法以SHI-1和K562细胞群为观察对象， 40~120 mg/L的F4抑制细胞增殖，抑制率达到20.1%~45.7%和26.0%~57.7%，提示低极性人参皂苷F4能够有效地抑制SHI-1和K562白血病细胞增殖。

诱导分化是指在分化诱导剂的作用下，诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常的细胞，其基本特点在于可不杀伤肿瘤细胞，而是诱导其细胞形态、功能及生物学行为等综合指标向正常方向变化。本实验表明，在40~120 mg/L的剂量范围内F4可诱导SHI-1和K562细胞形态出现分化的特征。与对照组比较，各组SHI-1和K562细胞出现不同程度的核/质比例缩小，染色质粗糙，核仁减少，可见空泡，且SHI-1细胞核有扭曲或折叠，初步证明F4可诱导SHI-1、K562细胞分化。K562细胞具有多向分化的能力，体内外研究表明，其在诱导剂作用下可以向红系、粒系和巨核系分化［10-12］。GATA-1调控K562细胞向红系、巨核系分化，其表达能力能够反应K562细胞的分化成熟程度［13-14］。本研究显示F4能够提高GATA-1在mRNA和蛋白水平的表达， γ-globin蛋白表达水平也有所提高。进一步研究表明CD14在K562细胞的表达水平也有所提高，提示F4可诱导K562细胞向红系和粒单系分化。为了研究F4诱导髓系白血病细胞向粒单系分化的作用，本实验采用F4处理SHI-1细胞，观察诱导单核细胞分化的作用。SHI-1细胞属于单核白血病细胞，构成性表达单核细胞分化特异的转录因子PU.1，提高PU.1表达能够促进SHI-1细胞分化成熟。CD11b主要表达在中性粒细胞，其表达水平与粒细胞分化成熟具有相关性［15］。F4能够提高CD11b在SHI-1细胞的表达，表明其能够提高中性粒细胞分化基因的表达，提示F4可能具有表观遗传调控的作用。

综上所述，低极性人参皂苷F4具有抑制髓系白血病细胞增殖及诱导分化的作用，为F4抗白血病的研究提供了实验依据，其诱导分化的作用机制尚待进一步深入研究。

［1］ Wen WW， Sun X， Zhuang HF， et al. Effects of panaxadiol saponins component as a new chinese patent medicine on proliferation， differentiation and corresponding gene expression profile of megakaryocytes［J］. Chin J Integr Med， 2016， 22（1）：28-35.

［2］ Wang C， He H， Dou G， et al. Ginsenoside 20（S）-Rh2induces apoptosis and differentiation of acute myeloid leukemia cells： role of orphan nuclear receptor Nur77［J］. J Agric Food Chem， 2017， 65（35）：7687-7697.

［3］余潇苓，高瑞兰，尹利明，等. 低极性人参皂苷Rh4对白血病细胞系K562细胞增殖抑制及诱导分化作用的研究［J］. 中华血液学杂志， 2015， 36（4）：347-349.

Yu XL， Gao RL， Yin LM， et al. The effects of low polarity ginsenoside Rh4on proliferation and differentiation in K562 leukemia cells［J］. Chin J Hematol， 2015， 36（4）：347-349.

［4］ Xia T， Wang YN， Zhou CX， et al. Ginsenoside Rh2and Rg3inhibit cell proliferation and induce apoptosis by increasing mitochondrial reactive oxygen species in human leukemia Jurkat cells［J］. Mol Med Rep， 2017， 15（6）：3591-3598.

［5］ Jang HJ， Han IH， Kim YJ， et al. Anticarcinogenic effects of products of heat-processed ginsenoside Re， a major constituent of ginseng berry， on human gastric cancer cells［J］. J Agric Food Chem， 2014， 62（13）：2830-2836.

［6］ Chen B， Shen YP， Zhang DF， et al. The apoptosis-inducing effect of ginsenoside F4from steamed notoginseng on human lymphocytoma JK cells［J］. Nat Prod Res， 2013， 27（24）：2351-2354.

［7］曹满，余河水，宋新波，等. 人参皂苷衍生化及其抗肿瘤构效关系研究进展［J］. 药学学报， 2012， 47（7）：836-843.

Cao M， Yu HS， Song XB， et al. Advances in the study of derivatization of ginsenosides and their anti-tumor structure-activity relationship［J］. Acta Pharm Sin， 2012， 47（7）：836-843.

［8］ Yang JJ， Yuan DH， Xing TC， et al. Ginsenoside Rh2inhibiting HCT116 colon cancer cell proliferation through blocking PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase ［J］. J Ginseng Res， 2016， 40（4）：400-408.

［9］ Tung NH， Song GY， Minh CV， et al. Steamed ginseng-leaf components enhance cytotoxic effects on human leukemia HL-60 cells［J］. Chem Pharm Bull， 2010， 58（8）：1111-1115.

［10］ 余潇苓，赵燕娜，郑智茵，等. 地西他滨抑制K562白血病细胞增殖和诱导分化的作用［J］. 中国病理生理杂志， 2017， 33（1）：13-17.

Yu XL， Zhao YN， Zhen ZY， et al. Effect of decitabine on proliferation and differentiation of K562 cells［J］. Chin J Pathophysiol， 2017， 33（1）：13-17.

［11］ 李赛，潘磊，高瑞兰，等. 蛇六谷提取物抑制K562细胞增殖并诱导分化的作用［J］.中国病理生理杂志， 2019， 35（4）：592-596.

Li S， Pan L， Gao RL， et al. Effect of TuAKe on proliferation and differentiation of K562 cells［J］. Chin J Pathophysiol， 2019， 35（4）：592-596.

［12］ Yang H， Hui H， Wang Q， et al. Wogonin induces cell cycle arrest and erythroid differentiation in imatinib-resistant K562 cells and primary CML cells［J］. Oncotarget， 2014， 5（18）：8188-8201.

［13］ Zhang C， Guo LY， Mu D， et al. Induction of apoptosis and erythroid differentiation of human chronic myelogenous leukemia K562 cells by low concentrations of lidamycin［J］. Oncol Rep， 2019， 41（1）：475-482.

［14］ Duncan MT， Shin S， Wu JJ， et al. Dynamic transcription factor activity profiles reveal key regulatory interactions during megakaryocytic and erythroid differentiation［J］. Biotechnol Bioeng， 2014， 111（10）：2082-2094.

［15］ Jensen HA， Bunaciu RP， Ibabao CN， et al. Retinoic acid therapy resistance progresses from unilineage to bilineage in HL-60 leukemic blasts［J］. PLoS One， 2014， 9（6）：e98929.

Effect of low-polarity ginsenoside F4on proliferation and differentiation of SHI-1 cells and K562 cells

LI Wan， GAO Rui-lan， YU Xiao-ling， YIN Li-ming， TANG Bi-qiang， LAN Gao-chen， LAN Jin-jian， ZHAO Yan-na

（，310006，）

To investigate the effects of low-polarity ginsenoside F4（F4） on the proliferation and differentiation of human monocytic leukemia SHI-1 cells and erythroid leukemia K562 cells.The SHI-1 cells and K562 cells were treated with F4at different concentrations （0， 40， 80 and 120 mg/L）. The suppressive effect of F4on cell proliferation was detected by MTT assay and colony formation assay with semi-solid culture. The morphologic features of the cells were observed under inverted microscope with Wright-Giemsa staining. The positive expression rates and fluorescence intensity of differentiation-associated antigens CD11b and CD14 were detected by flow cytometry and immunofluorescence method. The protein expression of differentiation-related transcription factor PU.1 in SHI-1 cells， and GATA-1 and γ-globin related to erythroid differentiation in K562 cells was analyzed by immunocytochemistry and Western blot. The mRNA expression of PU.1 and GATA-1 was detected by RT-qPCR.Compared with control （0 mg/L） group， F4inhibited the proliferation of SHI-1 cells and K562 cells （<0.01）， and induced these leukemic cells to differentiate， showing reduced nucleus/cytoplasm ratio， rough chromatin， reduced nucleoli， increased vacuoles， and distortion of SHI-1 cell nucleus. The positive expression rates of CD11b in SHI-1 cells and CD14 in K562 cells were increased significantly （<0.01）， and the immunofluorescence reaction changed from weak positive to strong positive. No significant change in the positive expression rates of CD14 in SHI-1 cells and CD11b in K562 cells was observed. At the same time， F4up-regulated the mRNA and protein expression levels of PU.1 and GATA-1， and the protein level of γ-globin （<0.05）.The low-polarity ginsenoside F4possesses anti-leukemia effect that inhibits the proliferation of SHI-1 cells and K562 cells， and induces differentiation by regulating the expression of differentiation-related PU.1， GATA-1 and γ-globin.

Low-polarity ginsenoside F4； SHI-1 cells； K562 cells； Cell proliferation； Cell differentiation

R730.23； R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.010

1000-4718（2020）11-1988-08

2020-06-09

2020-08-11

国家自然科学基金资助项目（No.81774068）；浙江省自然科学基金资助项目（No.LY20H290004; No.LQ19H290002）

Tel: 0571-87071625; E-mail: zyn77@126.com

（责任编辑：林白霜，罗森）