白藜芦醇对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用研究

陈妮娜，牛 迪

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是围生期窒息引起的新生儿缺血缺氧性脑损伤(HIBD)，可遗留永久性神经功能缺损，造成认知和运动功能障碍、脑瘫、癫痫等后遗症，不仅直接影响患儿的身心健康，同时给家庭、社会均造成极大负担[1]。在HIE的病理生理过程中，缺血缺氧刺激炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡过度激活与神经功能损害的发生密切相关，针对性地进行抗炎、抗氧化、抗凋亡是治疗HIE的常见思路[2-4]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是从虎杖、葡萄等植物、水果中提取的多酚类化合物，具有抗炎、抗凋亡的药理学作用，在缺血再灌注引起脑损伤、心肌损伤的过程中均起到保护作用[5-6]，但用于HIE治疗的效果尚不明确。基于此，本实验以HIBD的新生大鼠作为研究对象，具体分析Res对脑损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 取7 d龄新生SD雄性大鼠36只，体质量10～15 g，购自北京维通利华动物实验公司，生产合格证号：SCXK(京)2018-0001；Res购自Sigma公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自上海西唐公司，RIPA裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天公司，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、SIRT1、核转录因子-κB(NF-κB)的单克隆一抗购自Abcam公司。

1.2 分组、造模及干预方法 将36只7 d龄新生SD大鼠分为假手术组(Sham组)、HIBD组、Res组，每组12只。HIBD组和Res组按照下列方法造模：腹腔注射水合氯醛麻醉后取仰卧位，做颈正中切口、分离右侧颈总动脉并结扎；缝合切口后恢复2～3 h，将新生大鼠放入缺氧箱中，通气条件为8%O2及92%N2、1 L/min、37 ℃，持续2 h。完成造模后，Res组给予Res 60 mg/kg(体积50 μL)腹腔注射，Sham组、HIBD组给予50 μL生理盐水腹腔注射，然后放回母鼠身边继续喂养。

1.3 神经功能评价 造模后48 h，每组大鼠随机选取6只大鼠，参照Longa评分法对神经功能进行评价，共0～4分，得分越高提示神经功能缺损越严重。

1.4 脑组织含水量检测 将完成神经功能评价的6只大鼠处死，用干湿重法检测脑组织含水量，解剖缺血缺氧一侧脑组织，称湿重，而后放入100 ℃烘箱烘干24 h，称干重，计算脑组织含水量，脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重。

1.5 脑组织中炎症细胞因子的检测 造模后48 h，每组剩余的6只大鼠直接处死，解剖缺血缺氧一侧的脑组织后，采用RIPA裂解液裂解组织，提取蛋白，采用BCA试剂盒测定总蛋白含量，采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、ICAM-1的含量，计算每毫克总蛋白中TNF-α、IL-1β、ICAM-1的含量。

1.6 脑组织中蛋白表达的检测 取缺血缺氧一侧脑组织裂解后得到的蛋白，经BCA试剂盒定量后取30 μg蛋白进行蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测，将蛋白样本加入SDS-PAGE后进行电泳、电转膜，用5%脱脂牛奶封闭NC膜2 h，4 ℃孵育Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、SIRT1、NF-κB及β-actin的一抗过夜；次日，室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1 h，加入ECL显影液、曝光得到蛋白条带，根据条带灰度值并以β-actin为内参计算蛋白表达量。

2 结 果

2.1 3组神经功能缺损评分及脑组织含水量比较 造模后48 h，与Sham组比较，HIBD组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量均明显增加(P<0.05)；与HIBD组比较，Res组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量均明显下降(P<0.05)。详见表1。

表1 3组神经功能缺损评分及脑组织含水量比较(±s)

2.2 3组脑组织中炎症细胞因子含量比较 造模后48 h，与Sham组比较，HIBD组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量均明显增加(P<0.05)；与HIBD组比较，Res组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量均明显下降(P<0.05)。详见表2。

表2 3组脑组织中炎症细胞因子含量比较(±s) 单位：ng/mg pro

2.3 3组脑组织中凋亡基因表达比较 造模后48 h，与Sham组比较，HIBD组大鼠脑组织中Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达量均明显增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量明显减少(P<0.05)；与HIBD组比较，Res组大鼠脑组织中Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达量均明显减少(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达量明显增加(P<0.05)。详见表3及图1。

表3 3组脑组织中凋亡基因表达比较(±s)

图1 3组脑组织中凋亡基因的蛋白条带图

2.4 3组脑组织中SIRT1/NF-κB表达比较 造模后48 h，与Sham组比较，HIBD组大鼠脑组织中SIRT1蛋白表达量明显减少(P<0.05)，NF-κB蛋白表达量明显增加(P<0.05)；与HIBD组比较，Res组大鼠脑组织中SIRT1蛋白表达量明显增加(P<0.05)，NF-κB蛋白表达量明显减少(P<0.05)。详见表4及图2。

表3 3组脑组织中SIRT1、NF-κB表达比较(±s)

图2 3组脑组织中SIRT1/NF-κB的蛋白条带图

3 讨 论

HIE的发生与缺血缺氧刺激下炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡的过度激活密切相关，多种具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用的药物在HIE的治疗中展现出积极作用。Res是具有抗炎、抗凋亡、抗氧化作用的植物多酚，其广泛的药理学作用在近些年受到了越来越多的关注。在缺血再灌注引起心肌组织损伤及脑组织损伤的过程中、七氟烷暴露引起新生大鼠神经功能损害的过程中，Res均能起到保护作用[5-7]。本实验以7 d龄的新生大鼠为研究对象，在建立HIBD模型后用Res进行干预，通过神经功能缺损评分及脑组织含水量变化反映脑损伤的程度，结果显示，Res组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量均明显低于HIBD组，说明Res干预能够减轻新生大鼠HIBD，在脑损伤的过程中能够起到保护作用。Res的抗炎及抗凋亡活性已经在脑组织缺血再灌注损伤模型、七氟烷暴露致新生大鼠认知功能障碍模型中得到证实[8-9]。在缺血缺氧引起新生大鼠发生脑损伤的过程中，同样涉及炎症反应的过度激活。已有研究报道，在HIBD过程中，TNF-α、IL-1β、ICAM-1等具有促炎及黏附活性的细胞因子大量释放，介导了炎症细胞向脑组织的黏附、浸润及炎症反应的级联放大[10-11]。本实验结果与其吻合，HIBD组脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量明显增加，在造模后用Res干预，Res组脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量明显低于HIBD组，说明Res能够减少多种炎症细胞因子的释放，进而在HIBD的过程中起到抗炎作用并减轻炎症反应激活对神经功能的损害。

细胞凋亡的过度激活是HIBD过程中除炎症反应外的另一重要病理环节，线粒体凋亡途径是在缺血缺氧条件下介导细胞凋亡的主要机制[12]。Bax和Bcl-2是线粒体外膜上一对调节线粒体凋亡途径的分子，前者在线粒体外膜上形成同源二聚体，成为线粒体内细胞色素C进入胞浆的通道，高表达的Bax能够增加细胞色素C进入胞浆并通过一系列级联反应来使Caspase-3的前体裂解为有活性的Cleaved-Caspase-3并介导细胞凋亡[13]；后者在线粒体外膜上与Bax形成异源二聚体，阻碍Bax对细胞凋亡的促进作用，抑制Cleaved-Caspase-3的生成及细胞凋亡[14]。本实验结果显示，HIBD组脑组织中Bcl-2的表达明显减少，而Bax、Cleaved-Caspase-3的表达明显增多，说明缺血缺氧刺激了脑组织中线粒体途径凋亡的激活。在Res干预后，脑组织中Bcl-2的表达明显增加，而Bax、Cleaved-Caspase-3的表达明显减少，说明Res能够抑制缺血缺氧脑损伤过程中线粒体途径凋亡的激活。

SIRT1是神经元内感受能量代谢的分子，通过介导去乙酰化反应作用于下游NF-κB，抑制NF-κB的活性及表达并使受到NF-κB调控的炎症反应、细胞凋亡均受抑制[15]。当局部组织发生缺血缺氧时，能量代谢存在异常并使SIRT1的表达发生下调，进而使其抑制NF-κB的作用减弱并造成NF-κB介导的促炎、促凋亡效应增强[16-17]。本实验对SIRT1/NF-κB通路的分析显示，HIBD组大鼠脑组织中SIRT1的蛋白表达量均明显减少，NF-κB蛋白表达量明显增加，说明在HIBD过程中SIRT1受到抑制、下游NF-κB激活；应用Res干预后，脑组织中SIRT1的蛋白表达量明显增加，NF-κB的蛋白表达量明显减少，说明Res能够在HIBD的过程中调节SIRT1/NF-κB通路，这也可能是Res发挥抗炎、抗凋亡作用的分子机制。

综上所述，Res能够减轻新生大鼠HIBD，减轻脑组织中的炎症反应及线粒体途径细胞凋亡，调节SIRT1/NF-κB通路可能是Res发挥上述调节作用的分子机制。