多重PCR 技术在快速检测食源性致病菌中的研究进展

□ 于世成 安丘市疾病预防控制中心

目前，已有报道的食源性致病菌接近300 种，其中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌等都是最常见的，由其引发的食源性疾病对人类健康造成了极大的危害，是食品安全重大隐患。随着食品安全事故的频繁发生，人民对食品安全的关注程度越来越高。食品微生物检验作为食品安全检测的一项重要的技术手段，可为保障食品安全提供强有力的科学依据。当今社会飞速发展，传统微生物检验方法检验周期较长、培养鉴定繁琐复杂，已越来越难以满足现代社会食品安全快速检测的需要，因而更加快速简便高效的检测方法成为科研热点。近年来，随着现代分子生物技术的快速发展，PCR 技术被广泛应用于食源性致病菌检测领域。

1 PCR 技术发展概况

PCR 即聚合酶链式反应，简单来说就是一种使DNA 在短时间内呈指数增加的分子技术。PCR 是通过控制不同温度实现DNA 变性—退火—延伸这一过程的连续多次循环，每循环一次（约2 ～4 min）DNA 扩增一次，3 h就可以将特定DNA倍增成百上千万倍。经过30 多年的发展，PCR 技术已有十几种之多，例如QPCR、多重PCR、微滴式数字PCR、反转录PCR 等，目前被广泛应用于农业、医药、食品、考古等领域。在食品安全检测领域，PCR 技术主要应用于微生物、转基因食品的检测、动物源性成分检测等方面。

2 多重PCR 技术

多重PCR 的基本原理、反应试剂和操作过程与常规PCR 相同，不同之处在于可以在同一PCR 反应体系中同时加入多种特异性引物从而实现多种目的DNA 的同时扩增，在保留传统PCR 检测质量优势的同时显著减少检测步骤，具有高效性、系统性、经济简便性等特点，目前在食品中多种微生物的同时检测中得到广泛应用。

3 研究应用进展

3.1 在果蔬检测中的应用

大连理工大学博士冯可[1]根据鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7 和单核增生性李斯特菌4 种致病菌菌的靶基因设计特异性探针,建立了同时检测鲜切果蔬中这4种致病菌的多重实时荧光PCR 检测方法，对应的检出限分别为4.2×104、1.8×104、7.3×104CFU/mL 和5.4×104CFU/mL。

3.2 在肉及肉制品检测中的应用

河北农业大学食品科技学院潘彤媛等[2]分别选择沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 和小肠耶尔森氏菌基因组中高特异性的inv A 基因、ECs3032 和ail 基因,设计并筛选具有高特异性的引物，建立了鸡肉中沙门氏菌、大肠杆菌O157:H73 和小肠耶尔森氏菌种致病菌的多重PCR 检测方法，同时检测3 种菌的灵敏度为103CFU/mL，单菌培养物检测灵敏度均为101CFU/mL。

3.3 在乳及乳制品检测中的应用

徐州医科大学公共卫生学院姜华等[3]利用筛选出的3 对特异性较高的引物建立了一种同时检测婴幼儿配方奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3 种食源性致病菌的多重PCR 检测方法，其检出限达到103CFU/g。内蒙古农牧业科学院杜琳等[4]采用细菌基因组提取试剂盒提取生鲜乳中的布鲁氏杆菌基因组DNA，针对布鲁氏杆菌保守抗原Omp25、Omp31 设计引物,并设计细菌16S rDNA 基因序列作为内参引物，建立了生鲜乳中布鲁氏杆菌的多重PCR 检测方法，能够扩增出布鲁氏杆菌Omp25（140 bp）、Omp31（472 bp）特异性片段以及细菌16S rDNA 的通用片段，灵敏度可达1×105 CFU/mL。上海大学生命科学学院苗小草等[5]采用针对金黄色葡萄球菌nuc 基因、克罗诺杆菌属gyr B 基因、沙门氏菌omp C 基因和单核细胞增生李斯特菌hly 基因设计特异性引物，建立了同时快速检测乳品中检出率较高的这4 种食源性致病菌的四重PCR 方法，可同时检出初始菌浓度为1 CFU/mL 的4 种乳品致病菌。

3.4 在其他食品检测中的应用

大连工业大学晚观生等[6]以基因wzx O111、rfb EO157 为靶基因，建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111 和O157 的多重PCR 结合变性高效液相色谱技术，可以一次PCR 扩增同时检测大肠杆菌O111、O157，灵敏度达到25 CFU/mL。

随着科技水平和生物技术的进一步发展，多重PCR 技术在食品微生物快速检测中的应用已成为一种趋势。然而，在看到多重PCR 技术诸多优点的同时，也要清醒的认识到其存在的多对引物间干扰、易受抑制因子感染、扩增效率一致性不高等缺点。但相信今后更多简便快速、灵敏准确的食品微生物多重PCR 检测技术方法将会出现，并得到更加广泛的应用推广，为及时判定和有效预防食品安全事故的发生提供更加准确有效的方法与技术依据，这对于确保社会食品安全具有深远的现实意义。