不同营养类型植物病原真菌次生代谢产物合成基因簇的差异性研究

祝友朋，韩长志

西南林业大学生物多样性保护学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室， 昆明 650224

微生物中次生代谢产物的种类是由次生代谢合成基因簇决定的，次生代谢产物一般具有抗菌、免疫抑制、产生毒素、降低致病性等多种生物活性[1]，其作为人类疾病药剂及农林业植物病虫害药剂开发的重要来源，在医学和农业生产中发挥着重要作用。目前，国内外学者关于真菌次生代谢产物合成基因簇的研究主要集中在次生代谢产物挖掘[2]、次生代谢产物合成基因的筛选鉴定及其克隆[3]、聚酮合酶[4-5]和非核糖体肽合成酶[6-7]的作用等方面。关于细菌次生代谢产物合成基因簇的研究主要是利用antiSMASH数据库(antibiotics & secondary metabolite analysis shell)对635个细菌的次级代谢产物合成基因簇进行注释，发现40种基因簇中非核糖体肽合成酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)、细菌素(bacteriocin)、萜烯(terpene)等4种基因簇在所有的细菌门中都存在，其他的基因簇存在于某个门或2个及以上的门中[8]。植物病原丝状真菌作为侵染植物的重要微生物之一，其具有的分泌蛋白、碳水化合物活性酶以及次生代谢产物在损害植物免疫防卫反应系统方面发挥着重要的作用[9]。前期笔者所在研究室开展了关于植物病原丝状真菌及细菌分泌蛋白、CAZymes预测及功能解析工作[10]，然而，关于不同营养类型真菌中次级代谢产物合成基因簇及不同营养类型真菌与次生代谢产物合成基因簇之间的关系尚不明确。

antiSMASH数据库中关于微生物的次生代谢合成基因簇的种类共有59种，主要有聚酮合酶(PKS)、terpene和NRPS等[11]。其中，PKS能合成聚酮类化合物，主要有T1PKS、T2PKS和T3PKS，可用于研制抗生素、抗菌剂等；terpene是萜类化合物的总称，具有重要的生物活性，是进行产物研究和新药开发的重要来源；NRPS能合成非核糖体肽(non-ribosomal peptides,NRP)，在真菌的生长发育过程中发挥着重要作用，该蛋白在真菌致病过程中扮演着重要角色，由多个催化结构域组成的高度模块化的肽合成酶，包括腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)等[12]。前人研究发现，由苹果斑点落叶病(Altenariaalternata)产生的AM-毒素[13]、玉米圆斑病菌(Cochlioboluscarbonum)产生的HC-毒素[14]以及玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)[15]、水稻胡麻斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)[16]、拟南芥黑斑病菌(Alternariabrassicicola)[16]、柑橘褐斑病菌(Alternariaalternata)和禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)中的NPS6基因[17]以及苹果树腐烂病菌(Valsamali)的NPS12基因均与上述病原真菌的致病性有关[18]，在实现NRP合成及在真菌生长发育、信号传导及致病等过程中都发挥着重要的作用[19]。然而，不同营养类型植物病原真菌与不同类型次生代谢产物之间的关系尚不清楚。

本研究选择不同营养类型植物病原真菌开展次生代谢产物合成基因簇的注释工作，利用antiSMASH数据库进行注释分析，对比分析17种具有不同营养类型的植物病原菌和5种腐生营养型真菌的次生代谢产物合成基因簇，以期发现次生代谢产物合成基因簇与不同营养类型植物病原真菌之间的关系，为今后深入研究不同营养类型植物病原菌中次生代谢产物的作用机制及找寻新型药剂作用靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

选择植物病原真菌(活体营养型、半活体营养型以及死体营养型)、腐生营养型真菌等22种真菌开展次生代谢产物预测分析。包括4种活体营养型真菌：玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis)、玉米丝黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)、小麦秆锈病菌(Pucciniagraminis)、戈洛文白粉菌(Golovinomycesmagnicellulatus)；6种半活体营养型真菌：小麦叶枯病菌(Zymoseptoriatritici)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、希金斯炭疽菌(C.higginsianum)、西瓜炭疽菌(C.orbiculare)和假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)；7种死体营养型真菌：玉蜀黍双极蠕孢(Bipolarismaydis)、小麦叶斑病菌(Parastagonosporanodorum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、苜蓿轮枝菌(Verticilliumalfalfae)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)；5种腐生营养型真菌：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)。

1.2 不同真菌次生代谢产物合成基因簇差异分析

利用antiSMASH[11](https://fungismash.secondarymetabolites.org/#!/start)注释不同营养类型真菌的PKS、NRPS和TPS等基因簇。

1.3 数据分析

采用Microsoft office Excel 2010进行数据分析以及Origin 9.0作图软件对所获得的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同营养类型真菌中次生代谢产物合成基因簇种类对比分析

对22种真菌开展次生代谢产物合成基因簇预测分析，结果发现5个腐生营养型真菌的次生代谢产物合成基因簇的种类和数量差异较大，其中酿酒酵母仅有3个次生代谢产物合成基因簇，分别是NRPS-like、terpene和含β-内酯的蛋白酶抑制剂(betalactone)；黑曲霉具有12种共63个次生代谢产物合成基因簇(图1)。同时，在植物病原真菌中，半活体营养型真菌和死体营养型真菌的次生代谢产物合成基因簇的种类和数量都高于活体营养型真菌(图1)：半活体营养类型真菌中次生代谢产物合成基因簇种类有11～18种，数量34～76个；死体营养类型真菌中次生代谢产物合成基因簇种类有6～11种，数量20～51个；活体营养类型真菌中次生代谢产物合成基因簇种类有4～5种，数量6～19个。在半活体营养类型真菌中，次生代谢产物合成基因簇种类和数量最多的是希金斯炭疽菌；在死体营养类型真菌中，次生代谢产物合成基因簇种类最多的是尖孢镰刀菌，数量最多的是玉蜀黍双极蠕孢；在活体营养类型真菌中，次生代谢产物合成基因簇种类和数量最多的是戈洛文白粉菌。

2.2 不同类别次生代谢产物合成基因簇数量对比分析

进一步对不同营养类型真菌中次生代谢产物合成基因簇的数量进行分析，结果显示：22种真菌中编码次生代谢产物的基因簇类型有单一型和复合型，前者有10种，后者有26种(图2)。其中，单一型基因簇存在较多的是T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like等，在植物病原菌和腐生真菌中都存在(图2A)。对不同营养类型植物病原菌进行分析，结果显示，活体营养型植物病原菌中仅存在T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like基因簇，半活体营养型植物病原菌中存在的单一基因簇种类最多，其独特存在betalactone、依赖tRNA的环二肽合成酶(CDPS)、铁载体(siderophore)和Ⅲ型聚酮合酶(T3PKS)等基因簇(图2B)。复合型基因簇存在较多的是NRPS+T1PKS、T1PKS+NRPS、吲哚(indole)+T1PKS、T1PKS+indole、NRPS-like+T1PKS和T1PKS+NRPS-like，在半活体营养型、死体营养型病原菌和腐生真菌中存在(图2C)。

图1 不同营养类型真菌次生代谢产物合成基因簇的种类(A)和数量(B)对比分析

A,B：单一次生代谢产物合成基因簇分布情况；C,D：复合次生代谢产物合成基因簇分布情况。A,B：Distribution of single primary metabolite synthesis gene cluster; C,D：Compound secondary metabolite synthesis gene cluster distribution.

此外，半活体营养型病原菌中存在9种独特的复合型基因簇，分别是NRPS-like+terpene、NRPS+NRPS-like、NRPS+fungal-RiPP、NRPS+betalactone、NRPS-like+betalactone、betalactone+NRPS-like、indole+terpene、具有POP或UstH肽酶类型和修饰的真菌RiPP(fungal-RiPP)+terpene和NRPS+T1PKS+fungal-RiPP；死体营养型病原菌中存在6种独特的复合型基因簇，分别是NRPS+terpene、NRPS-like+NRPS、indole+NRPS+T1PKS、T3PKS+T1PKS、terpene+T1PKS+NRPS和T1PKS+NRPS-like+other；腐生真菌存在2种独特的复合型基因簇，分别是T1PKS+NRPS+indole和NRPS+NRPS-like+indole(图2D)。

2.3 不同营养类型植物病原菌中NRPS预测分析

对17个植物病原真菌的次生代谢产物NRPS合成基因簇开展分析，结果发现半活体营养类型真菌中NRPS基因簇5～11个，NRPS基因数为7～20个；死体营养类型真菌中NRPS基因簇数量3～9个，NRPS基因数量2～14个；活体营养类型真菌中NRPS基因簇数量1～3个，NRPS基因数量1～8个(图3)。上述结果表明，半活体和死体营养型病原菌中NRPS基因簇数量及NRPS基因数量均高于活体营养型病原菌。

2.4 不同营养类型植物病原菌中PKS预测分析

对17个植物病原真菌的次生代谢产物PKS合成基因簇开展分析，结果发现半活体营养类型真菌中PKS基因簇数量有5～27个，PKS基因数量6～48个，但T3PKS基因簇尚未预测出其基因组成情况；死体营养类型真菌中PKS基因簇数量7～20个，PKS基因数量7～40个；活体营养类型真菌中PKS基因簇数量0～1个，PKS基因数量0～2个(图4)。上述结果表明，半活体和死体营养型病原菌中PKS基因簇数量及PKS基因数量均高于活体营养型病原菌。

2.5 不同营养类型植物病原菌中萜烯预测分析

对17个植物病原真菌的次生代谢产物萜烯合成基因簇开展分析，结果发现半活体营养类型真菌中萜烯基因簇数量3～12个，死体营养类型真菌中萜烯基因簇数量2～13个，活体营养类型真菌中PKS基因簇数量2～4个(图5)。上述结果表明，半活体和死体营养型病原菌中萜烯基因簇数量均高于活体营养型病原菌。

A:NRPS基因簇的数量； B:NRPS基因的数量。A：The number of NRPS gene cluster; B：The number of NRPS genes.

A:PKS基因簇的数量； B:PKS基因的数量。A：The number of PKS gene clusters; B：The number of PKS genes.

图5 不同营养类型植物病原菌中所含有萜烯基因簇的数量对比情况

3 讨 论

对植物次生代谢基因簇的研究发现其参与合成苯并噁唑嗪酮、生氰糖苷、生物碱和萜烯等化合物，与植物的生长发育有关，并参与植物的防御反应[20]。前人对病原菌次生代谢产物基因的研究集中在NRPS基因和PKS基因，发现玉米小斑病菌[15]、水稻胡麻斑病菌[16]、拟南芥黑斑病菌[16]、柑橘褐斑病菌和禾谷镰刀菌中的NPS6基因[17]以及苹果树腐烂病菌NPS12基因均与致病性有关[18]；渐绿木霉[21]、黄曲霉[22]、大丽轮枝菌[23]和球孢白僵菌[5]的PKS基因与生长发育和侵染性有关。在植物与病原菌互作及病原菌损害植物的免疫防卫反应系统方面也有许多学者进行了相关研究。如赵中涛[24]通过比较基因组的方法对94个真菌的糖类活性酶进行分析，发现植物病原菌中半活体营养型和死体营养型真菌中糖类活性酶的种类和数量均高于活体营养型真菌；陈相永等[25]通过植物病原真菌寄生性与分泌蛋白组及CAZymes的比较分析，发现半活体营养型和死体营养型真菌分泌蛋白占全基因组序列的比例高于活体营养型真菌，半活体营养型和死体营养型真菌的糖基水解酶家族GH和多糖裂解酶家族PL的数量均高于活体营养型真菌，且半活体营养型和死体营养型真菌参与植物细胞壁纤维素、木聚糖、果胶等成分降解的基因也高于活体营养型真菌。

本研究发现半活体和死体营养型病原菌次生代谢产物合成基因簇存在复合基因簇，而活体营养型病原菌中仅存在单一基因簇，但核盘菌在油菜上的营养类型是死体营养型，而在小麦上营养类型则是活体营养型[26]，由于寄主植物不同而引起其次生代谢产物合成基因簇是否存在差异性尚不清楚，有待进一步确认。此外，T3PKS基因簇仅存在于半活体和死体营养型病原菌中，但未发现该基因簇的基因组成情况，其复合基因簇和T3PKS基因簇是否与非活体寄生有关有待进一步验证。同时，本研究对不同营养类型真菌的次生代谢产物合成基因簇进行对比分析，比较了NRPS基因簇、PKS基因簇和萜烯基因簇在不同营养类型真菌中的分布。然而，对于植物病原真菌中的次生代谢产物研究特别是对于编码基因的功能尚不清楚，严重制约着人们对次生代谢产物在植物病原真菌侵染植物后所发挥的作用的认知，有待于今后开展相关生物学试验研究。