基于高效解磷菌的煤矸石肥料制备及其应用潜力分析

王应兰，姜 雄，吉 俐，张景宁，谢承卫

(贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

我国的煤炭开采量和消费量在世界上都稳居首位[1]。煤矸石是在煤炭开采和洗选加工过程中产生的一种煤炭伴生矿物，但由于长久以来都没有得到有效的利用，因而成为我国排放量和堆积量最大的工业固体废弃物之一[2-5]。由于煤矸石堆积，大量土地资源被占用，而且煤矸石的大量堆积还会产生溃坝的风险；在堆放中，煤矸石还可能会发生自燃，从而产生SO2、NOx等有害气体。目前，煤矸石的利用主要集中在发电、建材生产、填埋、道路建设和采空区充填等方面[6-8]，利用方式简单，效率不高，并没有充分利用煤矸石中的相关成分。煤矸石中的有机质含量通常为15%～25%，且富含氮、磷、钾、钙和植物生长所需的其他元素，因此可用作制备微生物肥料的原料[9-11]。

研究发现，许多微生物都具有解磷能力，水、土壤、堆肥，以及植物体表广泛分布着解磷微生物[12-15]。在土壤微生物中，0.1%～0.5%的真菌、1%～50%的细菌和10%～50%的放线菌具有解磷能力[14，16]；因此，相对于解磷真菌，具有解磷能力的细菌和放线菌更易获得。解磷细菌能够将土壤中已经固化的磷和难溶的磷重新转化为可溶性磷，以供植物生长[17]。

近年来，有关利用解磷菌制备微生物肥料的研究逐渐增多。吴文丽等[18]将3株解磷细菌混合发酵，并将其与鸡粪按1∶9的比例混匀，按2 000∶1、20 000∶1的比例分别添加葡萄糖和尿素，制成解磷菌肥。刘灏等[19]以啤酒废水为基质，加入解磷菌进一步发酵制备解磷菌肥。也有研究利用解磷细菌来处理低品位磷矿，转化磷矿中的难溶性磷[20-22]。但是，鲜有利用解磷菌处理煤矸石制备肥料的报道。为此，本研究拟利用解磷菌处理煤矸石制备肥料，以期为相关研究提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

HH.S11-4型恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；DHG-9053AS型电热恒温鼓风干燥箱，上海经济区沈荡中新电器厂；AMA440N型全自动高压灭菌锅，美国Astell；PYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗机械厂；BK5000型生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；TGL-20M型台式高速冷冻离心机，长沙高新开发区湘仪贝克仪器仪表有限公司；TC-412型PCR仪，英国Techne；YCP-33A型电泳槽，北京六一仪器厂；Syngene凝胶成像系统，英国Syngene；UV2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；6400A型火焰光度计，上海精密科学仪器有限公司；JB-3型定时恒温磁力搅拌器，上海雷磁新泾仪器有限公司。

1.1.2 培养基

难溶性无机磷固体培养基：葡萄糖10 g，(NH4)SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3(PO4)210 g，15～20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

LB固体培养基：蛋白胨5 g，氯化钠5 g，牛肉膏1 g，酵母膏2 g，15～20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL，pH值7.4。

1.1.3 菌种来源

GZU-Mic02菌株分离自贵州某煤炭产区的风化煤矸石样品，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium，菌株保藏编号ACCC1011)购自中国农业微生物菌株保藏中心。

1.1.4 煤矸石

煤矸石样品来自于贵州某煤矸石山的低硫煤矸石。将煤矸石过20目(粒径830 μm)筛，经检测，其营养元素含量如下：全氮3.67 g·kg-1，全磷1.10 g·kg-1，全钾3.12 g·kg-1，全硫20.75 g·kg-1，有机质371.5 g·kg-1，有效磷7.44 mg·kg-1，有效钾0.11 g·kg-1，pH值7.5。

1.1.5 烟草

供试烟草品种为云烟87。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定

将细菌接种于LB固体培养基上，于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，染色后在显微镜下进行观察。

GZU-Mic02菌株的一系列生理生化试验，包括葡萄糖、乳糖和甘露糖的分解，明胶液化试验，半固体琼脂动力试验，以及精氨酸双水解试验等按照《常见细菌系统鉴定手册》[23]进行。

提取GZU-Mic02菌株的总DNA，并将其通过引物进行菌落聚合酶链式反应(PCR)，所使用的通用引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT)[24]。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃再延伸5 min；4 ℃终止反应。由上海立菲生物技术有限公司对获得的PCR产物进行测序。使用BLAST程序在NCBI数据库中分析基因序列，并使用Mega 5.05软件基于邻接法构建GZU-Mic02菌株的系统进化树。

1.2.2 菌株解磷效果的正交试验

课题组前期就煤矸石粒径、体系pH值、接菌量、培养时间、体系干湿程度、培养温度，以及振荡或静置培养这些因素对细菌解离煤矸石的影响程度进行了探究，根据单因素试验结果确定选取粒径、pH值、接菌量和培养时间作为正交试验的因素，分别设计GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌的L9(34)正交试验，各组试验处理煤矸石的量均为20 g。

GZU-Mic02菌株进行试验时：粒度的1～3水平分别设置为20目(840 μm)、100目(150 μm)、160目(96 μm)，pH值的1～3水平分别设置为5.5、6.0、6.5，接菌量的1～3水平分别设置为80、90、100 mL，培养时间的1～3水平分别设置为4、5、6 d。用巨大芽孢杆菌进行试验时：粒度的1～3水平分别设置为20目、100目、160目，pH值的1～3水平分别设置为7.5、8.0、8.5，接菌量的1～3水平分别设置为80、90、100 mL，培养时间的1～3水平分别设置为2、3、4 d。

1.2.3 煤矸石肥料的制备

根据正交试验结果得到菌株处理煤矸石的最优组合，并依其制备煤矸石肥料。将GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌接种于LB固体培养基上培养至对数期末期，然后在培养基中加入适量无菌生理盐水将细菌冲洗下来制成菌液，GZU-Mic02菌株的菌液浓度控制在(1.02～1.50)×1010CFU·mL-1，巨大芽孢杆菌的菌液浓度控制在(1.15～1.57)×1010CFU·mL-1。按照最优组合，将菌液与20 g煤矸石混匀，并用1 mol·L-1HCl或NaOH调节体系pH值，放入37 ℃恒温培养箱中培养至相应的时间，取出后晾干。

1.2.4 煤矸石肥料和土壤成分的测定

煤矸石肥料和土壤中的碱解氮、有效磷、速效钾、交换性钙含量，以及土壤磷吸收系数按照《土壤分析技术规范》[25]进行测定。

1.2.5 煤矸石肥料应用试验

用制备的煤矸石肥料进行盆栽试验。所使用的土壤取自于荒废菜地，供试植株为烟草。将制备的煤矸石肥料作为基肥一次性混入土壤中(每盆约500 cm3土壤中混入25 g煤矸石肥料)，再将烟苗移栽至土壤中。添加用GZU-Mic02菌株制备的煤矸石肥料的标为T1处理，添加用巨大芽孢杆菌制备的煤矸石肥料的标为T2处理，各设5个平行试验组，另设置不添加煤矸石肥料的对照处理(CK)。将移栽好的烟草盆栽在温室中培育25 d，记录培育前后烟草的生长情况，及土壤中碱解氮、有效磷、速效钾、交换性钙含量和土壤磷吸收系数的变化。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 菌落形态和显微形态

GZU-Mic02菌株在LB固体培养基上的菌落形态和菌体形态如图1所示。可以看出，GZU-Mic02是一株不透明、黄色、形状规则、边缘整齐、表面湿润有光泽的革兰氏阳性球菌，其单菌落大小约1 mm，在1 000倍显微镜下，菌体成双叠、四叠或八叠，无荚膜、鞭毛和芽孢。

图1 GZU-Mic02的菌落形态(A)和菌体形态(B)Fig.1 Colony characteristic (A) and microscopic characteristic (B) of GZU-Mic02

2.1.2 生理生化鉴定

将GZU-Mic02菌株分别接种于葡萄糖、硝酸盐还原、甘露醇、甘露糖、乳糖、明胶、胆汁七叶苷、精氨酸双水解、半固体琼脂微量生化管中，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h(明胶微量生化管培养48 h)；氧化酶试验采用氧化酶试纸和试液进行，接触酶试验用3%(体积分数)H2O2溶液进行。结果如表1所示：GZU-Mic02菌株为接触酶和氧化酶阳性，不分解葡萄糖、乳糖、明胶、胆汁七叶苷，精氨酸双水解、甘露糖、甘露醇和硝酸盐还原试验均为阴性，不具有运动性，其生理特性与藤黄微球菌(Micrococcusluteus)标准菌株基本相符。

表1 GZU-Mic02菌株与藤黄微球菌(Micrococcus luteus)标准菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of GZU-Mic02 and type strain of Micrococcus luteus

2.1.3 GZU-Mic02菌株的16S rRNA鉴定

系统发育树(图2)显示，GZU-Mic02菌株与Micrococcusluteusstrain WBZ(KC460989)在同一分枝上，亲缘关系最近。而且，BLAST比对结果显示，2株细菌的同源性达100%。综上，将GZU-Mic02菌株鉴定为藤黄微球菌。

图2 GZU-Mic02菌株的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of GZU-Mic02 strain based on 16S rRNA sequences

2.2 巨大芽孢杆菌和GZU-Mic02菌株解离煤矸石的正交试验结果

在GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌解离煤矸石的过程中，细菌的活性在很大程度上限定了解磷的效果。这2株菌均为好氧细菌，当煤矸石粒径较大时，体系中的溶氧量适宜，细菌活性较好；而当煤矸石粒径较小时，体系中的溶氧量降低，细菌活性降低。由于体系中除煤矸石外未添加其他碳源，因此，当接菌量过大时，可供细菌生存所需的碳源相对不足，细菌活性也随之下降。此外，每种细菌都有其适宜生存的pH值和生长周期，过酸或过碱的环境均会影响其活性，且培养时间过长、细菌进入衰亡期后，细菌活性和体系活菌数均降低，解磷效果亦随之降低。因此，应选择适宜的煤矸石的粒径、体系pH值、接菌量和培养时间来制备煤矸石肥料。

用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌解离煤矸石的正交试验结果分别如表2和表3所示。经分析，GZU-Mic02菌株解离煤矸石的最佳条件为：煤矸石粒径20目，体系pH值5.5，接菌量100 mL，培养时间6 d。巨大芽孢杆菌解离煤矸石的最佳条件为：煤矸石粒径20目，体系pH值8.5，接菌量80 mL，培养时间4 d。

表3 巨大芽孢杆菌的正交试验结果Table 3 Orthogonal experiment results of B.megaterium

表2 GZU-Mic02菌株的正交试验结果Table 2 Orthogonal experiment results of GZU-Mic02

根据正交试验得到的最佳条件，分别用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌制备煤矸石肥料，其碱解氮、有效磷、速效钾和交换性钙的含量如表4所示。可以看出，用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢杆菌制备的煤矸石肥料与煤矸石相比，具有更高的碱解氮、有效磷和速效钾含量，用GZU-Mic02菌株制备的煤矸石肥料比用巨大芽孢杆菌制备的煤矸石肥料有更高的碱解氮和有效磷含量，而用巨大芽孢杆菌制备的煤矸石肥料中的速效钾相含量比用GZU-Mic02菌株制备的煤矸石肥料要高一些。制备的煤矸石肥料中的交换性钙含量都比煤矸石要低，这是因为菌株在解磷的过程中会吸收钙离子。

表4 煤矸石和煤矸石肥料的成分Table 4 Composition of coal gangue and coal gangue fertilizers mg·kg-1

2.3 煤矸石肥料对烟草植株和植烟土壤的影响

从表5烟草培育过程中茎围、株高和叶片大小的生长变化情况可知，制备的煤矸石肥料对烟草生长均有促进作用，其中，用GZU-Mic02菌株制备的煤矸石肥料的促进作用要优于用巨大芽孢杆菌制备的煤矸石肥料。

表5 烟草培育过程中不同处理各长势指标的变化Table 5 Dynamic of tobacco growth indicators under different treatments

以未培育烟草且不施肥的土壤作为空白处理(T0)，对比T0、T1、T2和CK处理的土壤碱解氮、有效磷、速效钾、交换性钙含量和磷吸收系数，结果如表6所示。各处理中，空白处理的土壤碱解氮、有效磷、交换性钙含量和磷吸收系数最低，且显著(P<0.05)低于其他处理。与对照处理相比，施用制备的煤矸石肥料后，土壤的碱解氮、有效磷、速效钾含量和磷吸收系数均显著(P<0.05)升高。

表6 土壤的理化性质变化Table 6 Change of physical and chemical properties of soil

3 结论

本试验从风化的煤矸石中分离筛选出一株解磷菌GZU-Mic02，经过鉴定，该菌株为藤黄微球菌，且其解磷能力优于巨大芽孢杆菌。采用巨大芽孢杆菌和GZU-Mic02菌株解离煤矸石制备肥料，制备的煤矸石肥料对烟苗均有一定的促生作用，且以用GZU-Mic02菌株制备的煤矸石肥料的促生作用更佳。另外，制备的煤矸石肥料均会显著提高烟苗根际土壤中的碱解氮、有效磷、速效钾含量。

本研究说明，利用解磷菌解离煤矸石制备肥料是一种可行的煤矸石资源化利用的方式。目前，该方法仍停留在实验室阶段，若将其投入生产应用中，能在一定程度上缓解煤矸石大量堆积给环境带来的压力。