柱前衍生化-HPLC-MS/MS法测定启脾丸中掺假蜂蜜

朱韬，何颂华，吕轶峰，罗轶

广西壮族自治区食品药品检验所（南宁 530022）

启脾丸由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、山药、莲子、山楂、六神曲、麦芽、泽泻11味中药制成，具有健脾益气、消食化积、渗湿止泻的功效，用于脾胃虚弱、消化不良、腹胀便溏[1-2]。启脾丸由药材粉碎后加炼蜜制得，启脾丸中炼蜜所占比例较大，约为55%，炼蜜的质量直接影响启脾丸质量的优劣。

蜂蜜不仅是一种重要的天然食品，也是一种中药。天然蜂蜜中掺入淀粉类糖浆（大米糖浆、果葡糖浆等）是蜂蜜掺假中普遍存在的一种现象[3]。根据欧盟法规，蜂蜜是纯产品，添加或去除任何种类的物质均是非法的[4-5]。目前已有的蜂蜜掺假检测技术有薄层色谱法[6]、红外光谱法[7]、近红外光谱法[8]、核磁共振法[9]、液质联用法[3]等，这些技术各有特点，但是均存在一些缺陷，如操作复杂、耗时长、干扰大、灵敏度低等。试验前期对启脾丸中蜂蜜是否存在掺假进行了薄层色谱、蒸发光/紫外-高效液相色谱法等研究，结果均不理想。天然蜂蜜中几乎不含五糖（DP5）以上的寡糖，而各种淀粉糖浆中均含五糖（DP5）以上的寡糖[10]。此次试验采用1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）柱前衍生化-HPLC-MS/MS法，建立启脾丸中寡糖测定方法，可评价启脾丸是否使用掺假蜂蜜为原料进行生产，为提高蜂蜜掺假检测提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6460三重四极杆液质联用仪，电喷雾离子源（ESI），XP205型电子天平（Mettler Toledo公司）；5010-SPE6252-AC SPE柱（Shimadzu公司）。

麦芽六糖、麦芽七糖（ELICITYL-OLIGOTECH公司）；大米糖浆、果葡糖浆、木薯糖浆、甜菜糖浆、麦芽糖浆（市售）；1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮（PMP）（天津市光复精细化工研究所）；乙腈为色谱纯，水为Milli-Q制备的超纯水，其它试剂均为分析纯。62批启脾丸为2018国家评价性抽验样品。

1.2 色谱条件

色谱柱Waters CORTECS（150 mm×4.6 mm，2.7 μm），以乙腈为流动相A，水（0.1%甲酸）为流动相B，按表1比例进行洗脱；流速为0.5 mL/min，柱温为35 ℃。

表1 HPLC测定洗脱条件

1.3 质谱条件

采用电喷雾正离子模式（ESI+），多反应离子监测（MRM）；干燥气温度300 ℃；雾化器压力40 Psi；干燥气流速5 L/min；鞘流气温度300 ℃；鞘流气流速10 L/min；毛细管电压4 000 V；喷嘴电压500 V；选择m/z1 483.7→511.3（PMP-麦芽七糖）和m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）作为检测离子。

1.4 对照品溶液的制备

取适量麦芽六糖和麦芽七糖，精密称定，加水制成每1 mL含0.9 μg麦芽六糖、2.8 μg麦芽七糖的混合溶液，摇匀，即得。

1.5 启脾丸供试品溶液制备

取适量启脾丸，剪碎，取1 g，精密称定，置15 mL离心管中，精密加10 mL水，涡旋至全部溶散，离心（12 000 r/min）10 min，精密吸取1 mL上清液，缓缓加至活性炭固相萃取柱中，用25 mL 7%乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用10 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.6 衍生化试验

分别取200 μL上述对照品溶液和供试品溶液，加入200 μ L氨水和200 μ L 0.3 mol/L PMP甲醇溶液，在70 ℃下反应30 min，反应液用氮气吹干，加入1.0 mL高纯水使其溶解；加入1.0 mL三氯甲烷，振摇提取3次，弃去有机相，得到水相，过0.22 μ m滤膜，取滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 专属性试验

2.1.1 阴性对照溶液制备

依照中国药典2015年版一部启脾丸处方及制法加入各药材粉末（缺炼蜜），混匀，取1 g，精密称定，按上述方法制得。

2.1.2 炼蜜自身对照溶液的制备

取1 g炼蜜（按蜂蜜寡糖测定合格后炼得），精密称定，按上述方法制得。

2.1.3 阳性对照溶液的制备

分别取25 mg麦芽糖浆、果葡糖浆、大米糖浆、木薯糖浆、甜菜糖浆，按上述方法制得。

2.1.4 空白试剂溶液的制备

取200 μL高纯水进行衍生，按上述方法制得。

分别精密吸取1 μL衍生后溶液，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，即得，结果见表2。

表2 专属性试验结果

2.2 精密度试验

取批号818107的供试品溶液进行衍生，依法测定，连续进样6次。结果显示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麦芽七糖）峰面积RSD分别为1.03%和1.27%，说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

取批号818107的供试品溶液进行衍生，依法测定，在24 h内不同时间进样。结果显示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麦芽七糖）峰面积RSD分别为2.23%和2.40%，表明在24 h内各个被测物均稳定。

2.4 重复性试验

取6份批号818107供试品，依法测定。结果显示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麦芽七糖）峰面积RSD分别为2.31%和0.39%，表明所建方法重复性良好。

2.5 检出限

分别精密量取5和50 μL混合对照品溶液，分别加995和950 μL空白基质溶液，摇匀，即得检出限溶液。将上述对照品溶液按拟定色谱条件分别进样1 μL，测定。结果显示，麦芽六糖检出限为11.99 ng/g，麦芽七糖检出限为2.29 ng/g。

2.6 判定浓度的考察

在自制炼蜜中，分别按质量比加入1%，5%和10%的麦芽糖浆，与各中药材原粉混合制成掺伪样品。结果显示，1%麦芽糖浆掺伪样品中，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）峰面积与阴性相当，而5%麦芽糖浆掺伪样品中，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）峰面积约为阴性样品峰面积的10倍，可有效排除阴性干扰；因此依法制成含5%大米糖浆、麦芽糖浆、果葡糖浆、木薯糖浆和甜菜糖浆的掺假样品，分别取1 g上述样品，依拟定方法测定，结果见表3。

表3 模拟掺假样品和对照品

结果显示，以不同糖浆制成的蜂蜜掺伪样品，m/z1 321.5→511.3（PMP-麦芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麦芽七糖）的峰面积差异较大，因此以5%掺假糖浆平均峰面积为拟定限度的参考，分别折算出麦芽六糖浓度约为0.9 μg/mL，麦芽七糖浓度约为2.8 μg/mL。以该浓度进样，m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3峰面积与各类糖浆平均峰面积基本相当，见表3。

2.7 判定方法

在以m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现混合对照品溶液色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3的色谱峰面积值均应不得大于对照品溶液中相应的峰面积值。

2.8 样品测定

按拟定方法对62批启脾丸样品进行检测，结果发现62批启脾丸均检出麦芽六糖和麦芽七糖，其中5批启脾丸含糖浆掺假蜂蜜。

2.9 衍生化反应原理及条件优化

糖类与PMP反应，最终生成在糖分子加上2个分子的1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮的衍生产物，反应过程如图1所示。PMP只与还原糖反应，非还原糖不参与反应，其减少了启脾丸中多味药材的干扰，并且生成的衍生化产物稳定，解决了糖类物质难电离的问题。在质谱中响应弱的问题，可直接在质谱中进行检测。根据参考文献[11-12]，优化了衍生化反应条件，缩短了反应时间，用氨水代替NaOH溶液，无需加入盐酸中和，即无需脱盐便可进入质谱检测。

图1 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮与麦芽寡糖的衍生化反应

2.10 检测离子的选择

对混合对照品进行质谱分析，见图2和图3。

图2 PMP-麦芽七糖二级质谱图

图3 PMP-麦芽六糖二级质谱图

结果发现，PMP-麦芽七糖只有1个碎片离子，PMP-麦芽六糖有3个碎片离子，其中174.7和997.4响应较小，影响结果准确度，故选择m/z1 483.7→511.3和m/z1 321.5→511.3作为检测离子。

3 结论

在启脾丸的样品分析中，5批次启脾丸涉嫌使用掺假蜂蜜进行生产，可见市场蜂蜜质量堪忧，使用掺假蜂蜜严重影响中成药质量状况。此次试验针对糖浆掺假天然蜂蜜的普遍现象，以麦芽六糖和麦芽七糖为特征标记物，建立了柱前衍生液质联用检测启脾丸中掺假蜂蜜的方法。PMP衍生试验方法易于操控，灵敏度高，检测结果可靠准确，为蜂蜜及含蜂蜜中药制剂的质量控制和评价提供参考和思路。