3种不同纳豆主要活性成分货架期内变化

苗欣宇，李达，郑丽，迟燕平，王景会，牛红红

吉林省农业科学院，农产品加工研究所（长春 130033）

纳豆是以大豆为原料，经过纳豆芽孢杆菌（B.subtilis natto）发酵而成的传统食品。发酵可以提高食品的营养价值和感官性能[1]。纳豆芽孢杆菌在发酵大豆的过程中不仅能分解大豆中的大分子物质，如碳水化合物、蛋白质、脂肪等，使发酵产品中拥有丰富的有机酸、氨基酸、寡糖等易被人体吸收的小分子化合物[2]；还能在发酵时产生对人类有利的代谢产物，如具有溶血栓、改善血液循环的纳豆激酶（NK）[3]。纳豆芽孢杆菌本身具有抑制肠道中致病菌的生长繁殖、减少致病菌定植的作用，同时大豆异黄酮也具有许多生理学特性[4]，因此，纳豆富含多种活性物质，具有预防疾病和保健功能，备受国内外研究人员关注。

纳豆在生产以及货架冷藏期间活性物质会发生变化，从而影响其功效。甄珍[5]对5种风味纳豆中的7种活性成分在货架期内的变化进行跟踪测定，研究发现在货架期内7种活性成分有不同程度的显著性变化，其中脂肪酶活性相对稳定，而淀粉酶活性变化最大，结果表明7 d内纳豆可保持较高活性成分。张树明等[6]探讨黄豆、黑豆混合后发酵与发酵后混合纳豆中异黄酮含量的差异及最佳配比，认为黄豆、黑豆混合后发酵优于发酵后混合，并以1∶3配比时纳豆中染料木素及大豆苷元含量具有优势。

纳豆活性成分丰富，但是关于纳豆在货架期活性成分变化的研究较少。因此，试验采用3种不同小粒豆作为发酵原料，以前期试验中筛选的活力较好的纳豆芽孢杆菌进行发酵[7]，对货架期内纳豆基本理化成分、NK活性及异黄酮等成分变化进行测定，探讨纳豆的最佳食用时间，以期更好发挥纳豆保健功效，为纳豆生产加工、货架期保藏和消费提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与材料

纳豆芽孢菌（JLGZL-018，吉林省农业科学院农产品加工所食品微生物团队保藏）；3种小粒豆（市售，编号为103号、2号和8号）。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨、酵母浸粉（生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司）；牛凝血酶（1 000 U/支）、牛纤维蛋白原（纯度＞85%）（沈阳拜英生物技术有限公司）；注射用尿激酶标准品（100 000 IU/支，武汉人福药业有限责任公司）；酪蛋白（生化试剂，Sigma公司）；蒽酮、三氯乙酸、氢氧化钠（分析纯，上海国药）；邻苯二甲酸氢钾（基准试剂，国家标物中心）；甲醇、乙腈、乙酸（色谱级，美国默克公司）；大豆异黄酮标准品（HPLC级，上海源叶生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

改良LB培养基参照文献[7]。

1.2 仪器与设备

电子天平ME104/02、pH计FE28-Standard（瑞士Mettler Toledo公司）；紫外可见光分光光度计Cary300（美国Varian公司）；液相色谱仪WATRTS ACQUITY UPLC H-CLASS（美国沃特斯公司配紫外检测器）；凯氏定氮仪2300 k（丹麦FOSS公司）；超净工作台SW-CJ-1G（苏州净化设备股份公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵液制备及培养

按照文献[7]培养。10 000 r/min，4 ℃离心15 min，弃去上清液，用超纯水复溶菌体，得到活菌数为3×107～5×107CFU/mL的发酵液。

1.3.2 纳豆样品制备

纳豆加工按照文献[7]进行，5%接菌量，37 ℃发酵18 h，4 ℃冰箱冷藏。

样品分别在0，1，3，6和9 d取样，活菌数、纳豆激酶和氨基酸态氮立即测定，其余样品冷冻干燥，粉碎后过孔径0.180 mm筛，-20 ℃冻存备用。

1.3.3 活菌数测定

采用稀释平板法测定菌落总数。

1.3.4 理化指标测定

粗蛋白，按照GB/T 5009.5—2016[8]方法测定；可溶性总糖，采用蒽酮-浓硫酸比色法[9]测定；脂肪含量，采用索氏提取法[10]测定。氨基酸态氮，参考GB 5009.235—2016[11]方法进行测定。

1.3.5 纳豆激酶活力测定

参考Astrup等[12]纤维蛋白平板法测定。用生理盐水将注射用尿激酶逐级稀释成浓度为2 000，1 000，500，250和100 IU/mL标准溶液。其余按照文献[7]绘制标准曲线。

称取2.00 g研磨均匀的纳豆，加入20 mL生理盐水，按照文献[7]进行测定，根据尿激酶标准曲线计算。

1.3.6 样品中大豆异黄酮含量测定

参照马玉荣等[13]的方法，略作修改。HPLC色谱条件：色谱柱，C18柱2.1 mm×100 mm，1.7 μ m；波长260 nm；柱温25 ℃；进样量35 μ L；流速0.5 mL/min。流动相：A乙腈（0.1%乙酸）；B水（0.1%乙酸）。梯度洗脱：0～0.5 min，10% A，90% B；0.5～2 min，10%～12% A，90%～88% B；2～7 min，12%～45% A，88%～55% B；7～7.1 min，45%～90% A，55%～10% B；7.1～9 min，90% A，10% B；9～9.01 min，90%～10%A，10%～90% B；9.01～12 min，10% A，90% B。

标准曲线：将大豆苷（Daidzin）、大豆黄苷（Glycitin）、染料木苷（Genistin）、大豆素（Daidzein）、黄豆黄素（Glycitein）、染料木素（Genistein）标准品配制成不同浓度标准工作液，以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x）制作标准曲线。

样品测定：准确称取0.500 0 g样品于25 mL具塞试管中，加10 mL 90%甲醇溶液，超声提取30 min，涡旋振荡30 s，继续超声处理30 min，上清液10 000 r/min离心5 min，过0.22 μ m针孔式滤膜测定。按保留时间定性，使用标准曲线计算样品中异黄酮含量。

1.4 数据处理

所有试验3次重复，用SPSS 17.0软件对数据进行差异显性分析，数据用平均值±标准差表示，并用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 3种小粒豆原料主要成分分析

有研究表明以小粒豆为原料制作纳豆最佳[14]。从表1中可以看出，不同品种大豆各成分含量存在一定的差异，103号和8号水分含量较高。3种小粒豆粗蛋白含量以2号和8号含量较高；脂肪含量差异显著（p＜0.05），8号最高、103号脂肪含量最低。103号和8号可溶性总糖含量接近，显著高于2号豆。3种小粒豆均满足纳豆原料高蛋白、低脂肪的要求。

表1 3种黄豆主要成分含量（干基） %

2.2 纳豆活菌数在货架期内变化

从图1可知，3种不同小粒豆制成的纳豆在货架期内，随着时间延长，活菌数均呈现下降趋势。其中，2号和8号均在发酵完成时活菌数最高，分别为1.5×109CFU/g和7.2×109CFU/g，而103号在冷藏第1天时，活菌数最高，为1.3×109CFU/g。总的来看，3种纳豆在冷藏0～1 d时活菌数最高，且活菌数与李宏梁等[15]研究的10种市售纳豆活菌数差异不大。纳豆菌芽孢结构有耐受环境胁迫的能力[16]，可在人体肠道中定植生长促进营养物质吸收[2]，对人类健康起到重要作用，并且与NK含量具有密切联系[17]。因此选择合理时间食用，才能发挥纳豆菌功效，同时考虑适当后熟纳豆风味丰富，1 d左右食用较好。

图1 3种纳豆菌活菌数在货架期的变化

2.3 纳豆NK活性在货架期内变化

尿激酶标准曲线为y=0.209 8x+2.109 8（R2=0.995 4）。根据纤维蛋白平板法测定不同货架期3种纳豆粗酶液中的NK活性。图2显示，货架期内3种NK活性均呈现出先上升后下降趋势。2号和8号在冷藏3 d时，NK活性最高，分别为（4 046±360）IU/g和（4 198±279）IU/g；而103号在冷藏第1天时，NK活性最高，为（2 834±486）IU/g。结合图1，103号活菌数与NK活性在冷藏阶段生长趋势基本一致；2号和8号纳豆的活菌数在整个货架期内均呈现下降趋势，而NK活性表现出前3 d增加而后下降趋势，说明NK在这2种大豆上的合成模式是延续合成型[18]。冷藏时间继续延长，由于纳豆菌菌体衰老和死亡，酶促反应及代谢反应速率降低或终止，酶活降低[4]，3种纳豆NK活性持续缓慢下降。3种纳豆NK活性高，均满足已报道的商业化纳豆要求[19]，在1～3 d之内保健功效较好。

图2 3种纳豆NK活性在货架期的变化

2.4 纳豆理化指标在货架期内的变化

根据图3（A）和（B）可知，3种纳豆在整个货架期内蛋白含量在45.21%～47.05%之间小幅度波动，脂肪含量在20.50%～22.24%之间，在9 d的货架期内变化不大。货架期内大分子蛋白一方面被水解成小分子多肽或者氨基酸，同时菌体蛋白大量积累[20]，这2个过程处于平衡状态，蛋白含量变化不显著；另一方面纳豆菌生长过程中没有消耗脂肪作为碳源，脂肪含量相对稳定。从纳豆蛋白含量和脂肪含量变化趋势来看，货架时间对其影响不大。

根据测定结果，见图3（C），可溶性总糖作为优质碳源，在纳豆发酵过程中被纳豆菌利用，发酵后冷藏期间的可溶性总糖含量约为表1中原料的46.00%～66.39%。103号在冷藏1 d时，2号和8号纳豆则在冷藏3 d时可溶性总糖含量最低。3种纳豆可溶性总糖含量在整个货架期内变化不大，含量在4.29%～5.60%之间，因为在货架期过程中，纳豆菌菌体生长缓慢逐渐消亡，不需要可溶性总糖提供碳源，所以可溶性总糖含量处于相对稳定状态。

图3 3种纳豆理化指标在货架期的变化

食品发酵过程中氨基酸不仅能赋予发酵食品甜、苦、涩等多种味觉特征[21]，还可为微生物生长代谢提供氮源，促进发酵作用[22]，是食品发酵工业的一个重要指标，而氨基酸水平通常用氨基酸态氮表征，来衡量原料蛋白的水解程度、氮源水平及产品质量等[23]。根据图3（D）可知，3种纳豆氨基酸态氮含量在货架期内，都表现出先上升后下降的趋势，因为货架前期，后熟时间较短，可能发酵不完全，产生的酶不足以分解蛋白质产生游离氨基酸；后熟发酵时间过长，游离氨基酸可作为氮源被微生物利用，所以货架后期，氨基酸态氮含量下降。103号、2号和8号氨基酸态氮含量最高值分别出现在冷藏第1，第6和第3天，含量分别为0.58%±0.01%，0.61%±0.00%和0.52%±0.01%。从3种纳豆氨基酸态氮含量在货架期内变化可知，比较理想的食用时间应在1～6 d，此时氨基酸态氮含量较高，纳豆风味浓郁。

2.5 不同时期纳豆中大豆异黄酮含量的变化

大豆异黄酮是一种非固醇类、多酚类混合物，具有缓解骨质疏松和更年期症状、降低胆固醇和预防癌症等生理功能。主要分为糖苷型异黄酮和苷元型异黄酮，其中苷元型异黄酮比糖苷型异黄酮更易被人体消化吸收，功能性更强，微生物发酵可使大豆异黄酮糖苷型向苷元型转化，提高其生物活性[24]，对3种纳豆原料和货架期内，异黄酮总量和构成变化进行研究总结，可为纳豆产品开发提供理论基础。

纳豆原料和货架期过程中异黄酮总量变化如表2所示。3种小粒豆异黄酮总量在2 370.2～3 530.4 mg/kg之间，其中糖苷型异黄酮含量是异黄酮总量的91.0%～92.9%。发酵完成0 d时，103号和8号两种纳豆异黄酮总量显著高于原料豆（p＜0.5），而2号与原料豆差异不显著（p＞0.5）。纳豆发酵前经过浸泡和蒸煮两步加工程序后，小粒豆结构被破坏、变得松散，释放出大豆异黄酮数量较多，所以发酵后异黄酮提取率升高[25]。而随着货架期的延长，异黄酮总量均出现下降趋势，索化夷等[26]在研究豆豉后酵过程中发现异黄酮总量的下降是纳豆菌的生理活动引起的。3种纳豆货架期在3 d之内异黄酮含量较高，保健效果较好。

纳豆原料和货架期过程中苷元型大豆异黄酮变化如表2所示。发酵后，纳豆的苷元型异黄酮总量较原料豆有显著提高；货架期，3种纳豆苷元型异黄酮总含量最高分别为（2 197.4±133.6）mg/kg，（1 551.5±15.7）mg/kg和（1 381.7±14.3）mg/kg，是原料豆的12，4.9和8.1倍。苷元型异黄酮含量占异黄酮总量的比例，则分别从原料的7.1%，9.0%和7.2%上升到货架期最高值的36.1%，39.8%和25.1%。大豆素和染料木素是2种主要的苷元型异黄酮。货架期内，大豆素含量最高时较原料豆分别增加19.8%，5.6%和7.4%，染料木素则分别增加3.8%，8.1%和10.1%，说明大豆经过纳豆菌发酵及货架期后酵，可有效提高异黄酮的生物活性。异黄酮发生转化是因为纳豆菌发酵过程中产生的β-葡萄糖苷酶的作用，该酶可作用于糖苷型异黄酮分子中的氧苷键，使其葡萄糖苷基团脱掉，从而转化成具有更高生物活性的苷元型异黄酮[24-25]。

3种纳豆苷元型异黄酮含量最高点出现在货架期0～1 d之内，随着货架期延长其含量下降。有研究表明，苷元型异黄酮并不是异黄酮转化的最终产物，如大豆素可在特定微生物作用下转化为化学结构更有稳定、功能性更强的代谢终产物——雌马酚[27]，由此推断纳豆中苷元型异黄酮有可能进一步转化为其他代谢产物，导致货架后期其含量降低，对于纳豆中苷元型大豆异黄酮的转化需要进一步研究。3种不同纳豆在整个货架期异黄酮总量及糖苷型和苷元型含量变化规律显示，货架期不易过长，0～3 d是最佳食用时间。

表2 3种纳豆不同时期大豆异黄酮各组分含量变化

3 结论

测定3种纳豆中的活性成分含量在货架期内的变化趋势，结果表明，3种纳豆中的几种营养活性物质在货架期期间有不同程度的变化。其中，蛋白质、脂肪、可溶性总糖含量整体相对稳定；活菌数在0～1 d时菌体数最高；NK呈现先升高后下降趋势，并且均在1～3 d时达到峰值；氨基酸态氮含量在货架期间呈现出先升高后下降趋势，103号、2号和8号豆分别在货架期第0，第3和第6天时含量最高；异黄酮总量与苷元型异黄酮总量变化趋势相同，表现为缓慢下降或者前期增加然后下降的趋势，异黄酮总量最高点在0～3 d之内，苷元型异黄酮总量峰值也分别出现在货架期0～1 d之间。

大部分活性物质含量在货架期内表现出先上升后下降趋势。综合3种纳豆在货架期营养指标变化，认为货架期3 d之内食用，纳豆中活性成分如NK活力较高、苷元型异黄酮等物质含量较高，能更好地发挥纳豆的保健功效，并且3种纳豆活菌数、NK活性等指标均高于市售纳豆。试验结果可为纳豆货架期冷藏及合理食用提供参考。有关不同生产工艺、纳豆中其它品质在货架期中的变化，以及大豆异黄酮含量变化及机制有待进一步研究。